Laser-induceret hjerneskade i Motor Cortex af rotter

Summary

Protokollen præsenteres her viser en teknik til at skabe en gnaver model af hjerneskade. Den metode, der er beskrevet her bruger laserbestråling og mål motor cortex.

Abstract

En fælles teknik til at fremkalde slagtilfælde i eksperimentelle gnaver modeller indebærer forbigående (ofte betegnet som MCAO-t) eller permanent (udpeget som MCAO-p) okklusion af den midterste cerebral arterie (MCA) ved hjælp af et kateter. Denne almindeligt accepterede teknik har dog visse begrænsninger, hvilket begrænser dens omfattende anvendelse. Slagtilfælde induktion ved denne metode er ofte karakteriseret ved høj variation i lokalisering og størrelse af det iskæmiske område, periodiske forekomster af blødning, og høje dødelighed. Også en vellykket gennemførelse af nogen af de forbigående eller permanente procedurer kræver ekspertise og varer ofte i ca. 30 minutter. I denne protokol præsenteres en laserbestrålingsteknik, der kan tjene som en alternativ metode til at fremkalde og studere hjerneskade i gnaveremodeller.

Sammenlignet med rotter i kontrol- og MCAO-grupperne viste hjerneskaden ved lasertiluktion nedsat variation i kropstemperaturen, infarkt volumen, hjerneødem, intrakraniel blødning og dødelighed. Endvidere, brugen af en laser-induceret skade forårsaget skader på hjernen væv kun i den motoriske cortex i modsætning til i MCAO eksperimenter, hvor ødelæggelse af både den motoriske cortex og striatal væv er observeret.

Resultaterne af denne undersøgelse tyder på, at laserbestråling kan tjene som en alternativ og effektiv teknik til at fremkalde hjerneskade i den motoriske cortex. Metoden forkorter også tiden for at afslutte proceduren og kræver ikke sagkyndige.

Introduction

Globalt, slagtilfælde er den næststørste dødsårsag og den tredje hyppigste årsag til handicap¹. Slagtilfælde fører også til alvorlige handicap, ofte kræver ekstra pleje fra medicinsk personale og pårørende. Der er derfor behov for at forstå de komplikationer, der er forbundet med lidelsen, og forbedre risikoen for mere positive resultater.

Brugen af dyremodeller er det første skridt til at forstå sygdomme. For at sikre de bedste forskningsresultater, en typisk model ville omfatte en simpel teknik, overkommelige priser, høj reproducerbarhed, og minimal variation. Determinanterne i iskæmisk slagtilfælde modeller omfatter hjerneødem volumen, infarkt størrelse, omfanget af blod – hjerne barrieren (BBB) opdeling, og funktionel svækkelse generelt evalueret via neurologiske sværhedsgrad score².

Den mest udbredte slagtilfælde induktion teknik i gnaver modeller okklusioner den midterste cerebral arterie (MCA) forbigående eller permanent³. Denne teknik producerer en slagtilfælde model svarende til dem hos mennesker: det har en penumbra omkring strøg område, er meget reproducerbar, og regulerer iskæmi varighed og reperfusion⁴. Ikke desto mindre, MCAO metode har nogle komplikationer. Teknikken er tilbøjelig til intrakraniel blødning og skade på ipsilateral nethinden med en dysfunktion af den visuelle cortex og fælles hypertermi, der ofte fører til yderligere resultater^5,6,7. Andre begrænsninger omfatter store variationer i induceret slagtilfælde (som følge af den sandsynlige udvidelse af iskæmi til utilsigtede regioner, ligesom den eksterne halspulsåre region), utilstrækkelig okklusion af MCA, og for tidlig reperfusion. Også rotter af forskellige stammer og størrelser udviser forskellige infarkte mængder⁸. Ud over alle de nævnte ulemper, MCAO model kan ikke fremkalde små isolerede slagtilfælde i dybe hjerneområder, fordi det er begrænset teknisk med hensyn til sit krav om minimum fartøjsstørrelse for kateterisation. Dette gør behovet for en alternativ model endnu mere kritisk. En anden metode, fotothrombosis, giver et muligt alternativ til MCAO procedurer, men forbedrer ikke effektiviteten⁹. Denne teknik er rettet mod slag med lys og tilbyder nogle forbedringer på de tidligere modeller. Men, fotothrombosis kræver en invasiv kraniotomi, der er forbundet med sekundære compications⁹.

I lyset af skitserede mangler, den protokol, der præsenteres her giver en dygtig alternativ laser teknik til at fremkalde hjerneskade hos gnavere. Virkningsmekanismen af laser teknik er baseret på laserens fototermiske virkninger bibringes på levende væv, hvilket fører til absorption af lysstråler af kroppens væv og deres konvertering til varme. Fordelene ved at bruge en laser teknik er dens sikkerhed og nem manipulation. En laser evne til at producere varme til at stoppe blødningen gør det meget vigtigt i medicin, mens dens evne til at forstærke forskellige bjælker på et givet mødes punkt sikrer, at lasere undgå at ødelægge sundt væv, der står i vejen for målet punkt¹⁰. Laserstrålen, der anvendes i denne protokol kan passere gennem et lavt flydende medium, såsom knogle, uden at udsende sin energi og / eller forårsager nogen ødelæggelse. Når det når et højt flydende medium, såsom hjernevæv, det bruger sin energi til at ødelægge målet væv. Teknikken, derfor, kan fremkalde hjerneskade kun i det relevante område af hjernen.

Den teknik, der præsenteres her, viste en enorm mængde af evnen til at regulere dens niveauer af bestråling, der producerer de valgte variationer af hjerneskade beregnet fra starten. I modsætning til den oprindelige MCAO, der påvirker både cortex og striatum, laser teknik var i stand til at regulere virkningen af hjerneskade, inducerende skade kun på den tilsigtede motoriske cortex. Heri, laser-induceret hjerneskade protokol og et resumé af repræsentative resultater for proceduren udføres på hjernebarken af rotter leveres.

Protocol

Følgende procedure blev gennemført i overensstemmelse med retningslinjerne for anvendelse af forsøgsdyr i Det Europæiske Fællesskab. Forsøgene blev også godkendt af Animal Care Committee på Ben-Gurion University of the Negev. 1. Udvælgelse og forberedelse af dyr Vælg 65 mandlige Sprague-Dawley rotter vejer 300 til 350 g uden overt patologi for denne procedure. Den mindre størrelse giver tekniske vanskeligheder for MCAO-proceduren. Tildel 3 rotter pr bur og lad de…

Representative Results

Der blev ikke registreret dødsfald eller SAH i hverken kontrol- eller forsøgsgrupperne (tabel 1). MCAO-gruppen havde en 20% sats af både dødelighed og SAH. De relative ændringer i kropstemperaturen i rotter i begge grupper var også ens, på trods af en forskel i variabiliteten i begge grupper (tabel 1). Der var en betydeligt værre NSS i både lasermodellerne (16 ± 1,1) og MCAO (20 ± 1,5) sammenlignet med den sham-opererede …

Discussion

Det er rimeligt at antage, at laser teknik er minimalt invasive, da ingen dødsfald eller SAH opstod i lasergruppen. Den primære dødsårsag og SAH er skader på blodkar, der fører til en højde af intrakranielt tryk (ICP), som vist i de oprindelige MCAO teknikker¹⁰. Fraværet af død og SAH i lasergruppen skyldes sandsynligvis de specifikke virkninger af lasere: de har ikke direkte indvirkning på blodkarrene og kan fremkalde koagulation i tilfælde af lækage. Lav infarkt volumen og hjerne ød…

Materials

2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	SIGMA – ALDRICH	298-96-4
50% trichloroacetic acid	SIGMA – ALDRICH	76-03-9
Brain & Tissue Matrices	SIGMA – ALDRICH	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	1.83604E+11
Centrifuge Sigma 2-16P	SIGMA – ALDRICH	Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances	SIGMA – ALDRICH	HR-AZ/HR-A
Digital Weighing Scale	SIGMA – ALDRICH	Rs 4,000
Dissecting scissors	SIGMA – ALDRICH	Z265969
Eppendorf pipette	SIGMA – ALDRICH	Z683884
Eppendorf Tube	SIGMA – ALDRICH	EP0030119460
Ethanol 96 %	ROMICAL		Flammable Liquid
Evans Blue 2%	SIGMA – ALDRICH	314-13-6
Fluorescence detector	Tecan, Männedorf Switzerland	model Infinite 200 PRO multimode reader
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Infusion Cuff	ABN	IC-500
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
Multiset	TEVA MEDICAL	998702
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Optical scanner	Canon	Cano Scan 4200F
Petri dishes	SIGMA – ALDRICH	P5606
Scalpel blades 11	SIGMA – ALDRICH	S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine	Laser Industries Ltd
Stereotaxic head holder	KOPF	900LS
Sterile Syringe 2 ml	Braun	4606027V
Syringe-needle 27 G	Braun	305620