Multiphotonmikroskopische Beobachtung von Gefäßen im Mauslebergewebe
Summary
In diesem Experiment wird eine Maus in ihre Schwanzvene mit Rhodamine B Isothiocyanat-Dextran injiziert, die Blutgefäße färben können. Nachdem die Leber exponiert und fixiert wurde, kann ein bestimmter Teil der Leber ausgewählt werden, um das tiefe Gewebe im lebenden Körper mittels Multiphotonenmikroskopie zu beobachten.
Abstract
Die Beobachtung der intravaskulären Dynamik des Lebergewebes der Maus ermöglicht es uns, weitere eingehende Beobachtungen und Studien über gewebebedingte Erkrankungen der Mausleber durchzuführen. Eine Maus wird mit einem Farbstoff injiziert, der Blutgefäße färben kann. Um die Mausleber in vivo zu beobachten, wird sie freigelegt und in einem Rahmen fixiert. Mit einem Multiphotonenmikroskop werden zwei- und dreidimensionale Bilder der Blutgefäße im Lebergewebe gewonnen. Bilder der Gewebe an den ausgewählten Standorten werden kontinuierlich erfasst, um langfristige Veränderungen zu beobachten; die dynamischen Veränderungen der Blutgefäße in den Lebergeweben werden ebenfalls beobachtet. Die Multiphotonenmikroskopie ist eine Methode zur Beobachtung der Zell- und Zellfunktion in tiefen Gewebeabschnitten oder Organen. Die Multiphotonenmikroskopie hat eine Empfindlichkeit gegenüber Gewebemikrostrukturen und ermöglicht die Abbildung von biologischen Geweben mit hoher räumlicher Auflösung in vivo, wodurch die biochemischen Informationen der Organisation erfasst werden können. Multiphotonenmikroskopie wird verwendet, um einen Teil der Leber zu beobachten, aber die Leber zu fixieren, um das Bild stabiler zu machen, ist problematisch. In diesem Experiment wird ein spezieller Vakuumsauger verwendet, um die Leber zu fixieren und ein stabileres Bild der Leber unter dem Mikroskop zu erhalten. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um dynamische Veränderungen bestimmter Substanzen in der Leber zu beobachten, indem solche Stoffe mit Farbstoffen markiert werden.
Introduction
Blutgefäße können Nährstoffe für verschiedene Organgewebe des menschlichen Körpers liefern, und Austausch Substanzen. Gleichzeitig funktionieren viele Zytokine, Hormone, Medikamente und Zellen auch durch Gefäßtransport zu bestimmten Orten. Die Beobachtung von Gefäßveränderungen im Lebergewebe kann helfen, die Verteilung des Blutflusses im Lebergewebe und den Transport von Substanzen zu verstehen, und bei der Analyse bestimmter vaskulärer Erkrankungen helfen1,2.
Es gibt viele Möglichkeiten, die Blutgefäße der Leber bei Mäusen zu beobachten. Unter ihnen hat die optische Mikroskopie viele Einschränkungen bei der Beobachtung von undurchsichtigem Gefäßgewebe3. Multiphotonenmikroskopie kann verwendet werden, um die Blutgefäße von lebenden Lebern mit nichtinvasiver hoher Auflösung4abzubilden. Es können nicht nur dreidimensionale Bilder von Blutgefäßen gewonnen werden, sondern die Technik kann auch verwendet werden, um das Gewebe zu organisieren, um biologische Effekte darin zu beobachten; darüber hinaus kann das gesamte Gewebe abgebildet werden und nicht nur die Mikrogefäße wie in der Computertomographie und Magnetresonanztomographie5.
Multiphotonenmikroskopie kann verwendet werden, um verstreute fluoreszierende Signale in tiefem lebendem Gewebe effektiv zu erkennen, mit weniger Phototoxizität6. Daher kann die Aktivität des lebenden Gewebes sichergestellt werden, und die Höhe der Schäden kann reduziert werden. Die Multiphotonenmikroskopie hat eine bessere Durchdringende Leistung als die konfokale Mikroskopie, so dass tiefere Schichten beobachtet werden können7, die einzigartige 3D-Bildgebung bietet. Multiphotonenmikroskopie wird heute oft in bildgebenden Hirnnerven8 verwendet und wurde auf die Untersuchung der neuronalen Dynamik bei lebenden Mäusen9,10,11erweitert.
In diesem Experiment wird die Leber nach der fluoreszierenden Kennzeichnung von Mausblutgefäßen in einem Rahmen fixiert, und die Dynamik der Blutgefäße im lebenden Lebergewebe kann mit der Multiphotonenmikroskopie beobachtet werden. Dieses Experiment zeigt, wie man bestimmte Substanzen markiert, Multiphotonenmikroskopie verwendet, um einen Ort im Gewebe zu beobachten, zelluläre Ereignisse im interzellulären Gewebe zu beobachten, photochemische Messungen12,13,14zu machen und die Materialdynamik im lebenden Gewebe zu beobachten15. Zum Beispiel wurde der Tumorendothelmarker 1 (TEM1) als neuartiger Oberflächenmarker identifiziert, der auf den Blutgefäßen und Stroma in vielen soliden Tumoren hochreguliert ist und einkettiges variables Fragment (scFv) 78 gegen TEM1 markiert und dann die Multiphotonenmikroskopie für die Position des Maushämangioms und die Bewertung von Tumoren16verwendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Beobachtung eines bestimmten lebenden Gewebes ist ein wirksames Mittel, um die Veränderungen, Lokalisierung und biologischen Wirkungen des Materials im Gewebe zu verstehen17. In diesem Experiment sind die wichtigen Schritte die Fixierung der Leber mit einer Organbildvorrichtung, die das Problem der Bewegungsartefakte durch Atmung und Herzschläge lösen kann, und der Einsatz eines Multiphotonenmikroskops zur Beobachtung. Mit dieser Methode werden die inneren Gewebe der Leber in vivo durch ein…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81772133, 81902444), dem Guangdong Natural Science Fund (2020A1515010269, 2020A1515011367), dem Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034, 201903010072) und dem Military Medical Innovation Project (17CXZ008).
Materials
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
Referências
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