תצפית מיקרוסקופית מולטיפוטון של כלי רקמת כבד עכבר
Summary
בניסוי זה, עכבר מוזרק בווריד הזנב שלו עם רודמין B isothiocyanate-dextran שיכול להכתים כלי דם. לאחר שהכבד נחשף ומתוקן, ניתן לבחור חלק מסוים של הכבד כדי להתבונן ברקמה העמוקה בגוף החי באמצעות מיקרוסקופיה מולטי פוטון.
Abstract
התבוננות בדינמיקה התוך-וסקולרית של רקמת הכבד של העכבר מאפשרת לנו לבצע תצפיות מעמיקות נוספות ומחקרים על מחלות הקשורות לרקמות של כבד העכבר. עכבר מוזרק עם צבע שיכול להכתים כלי דם. כדי להתבונן בכבד העכבר ב vivo, הוא חשוף ומתוקן במסגרת. תמונות דו מימדיות ותלת מימדיות של כלי הדם ברקמת הכבד מתקבלות באמצעות מיקרוסקופ מולטי פוטון. תמונות של הרקמות באתרים שנבחרו נרכשות ברציפות כדי לבחון שינויים ארוכי טווח; השינויים הדינמיים של כלי הדם ברקמות הכבד נצפו גם. מיקרוסקופיה מולטי פוטון היא שיטה להתבוננות בתפקוד התא והתא בחלקי רקמות עמוקים או באיברים. מיקרוסקופיה מולטי פוטון יש רגישות מיקרו מבנה רקמות ומאפשר הדמיה של רקמות ביולוגיות ברזולוציה מרחבית גבוהה vivo, מתן היכולת ללכוד את המידע הביוכימי של הארגון. מיקרוסקופיה מולטי פוטון משמש כדי לבחון חלק מהכבד אבל תיקון הכבד כדי להפוך את התמונה יציבה יותר הוא בעייתי. בניסוי זה, יניקה ואקום מיוחד משמש כדי לתקן את הכבד ולקבל תמונה יציבה יותר של הכבד מתחת למיקרוסקופ. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש כדי לבחון שינויים דינמיים של חומרים ספציפיים בכבד על ידי סימון חומרים כאלה עם צבעים.
Introduction
כלי דם יכולים לספק חומרים מזינים עבור רקמות איברים שונות של גוף האדם, ולהחליף חומרים. במקביל, ציטוקינים רבים, הורמונים, תרופות ותאים מתפקדים גם באמצעות הובלת כלי דם למקומות ספציפיים. התבוננות בשינויים בכלי הדם ברקמת הכבד יכולה לסייע בהבנת התפלגות זרימת הדם ברקמת הכבד והובלת חומרים, ולסייע בניתוח של מחלות מסוימות הקשורות לכלי הדם1,2.
ישנן דרכים רבות להתבונן בכלי הדם של הכבד בעכברים. ביניהם, מיקרוסקופיה אופטית יש מגבלות רבות בהתבוננות רקמת כלי דם אטומים3. מיקרוסקופיה מולטי פוטון יכול לשמש כדי לדמיין את כלי הדם של כבדים חיים עם רזולוציה גבוהה פולשנית4. לא רק תמונות תלת מימדיות של כלי דם ניתן להשיג, אבל הטכניקה יכולה לשמש גם כדי לעזור לארגן את הרקמה כדי לבחון את ההשפעות הביולוגיות בו; יתר על כן, הרקמה כולה ניתן לדמיין ולא רק את microvessels כמו טומוגרפיה ממוחשבת הדמיה תהודה מגנטית5.
מיקרוסקופיה מולטי פוטון ניתן להשתמש כדי לזהות ביעילות אותות פלואורסצנטיים מפוזרים ברקמה חיה עמוקה, עם פוטוטוקסיות פחות6. לכן, ניתן להבטיח את הפעילות של רקמה חיה, ואת כמות הנזק ניתן להפחית. מיקרוסקופיה מולטי פוטון יש כוח חודר טוב יותר מאשר מיקרוסקופיה confocal, המאפשר שכבות עמוקות יותר להיות שנצפו7, מתן הדמיה 3D ייחודי. מיקרוסקופיה מולטי פוטון משמשת כיום לעתים קרובות בהדמיית עצביגולגולת 8 והורחבה לחקר הדינמיקה העצבית בעכבריםחיים 9,10,11.
בניסוי זה, לאחר תיוג פלואורסצנטי של כלי דם של העכבר, הכבד קבוע במסגרת, ואת הדינמיקה של כלי הדם ברקמת הכבד החי ניתן לראות באמצעות מיקרוסקופיה מולטי פוטון. ניסוי זה מדגים כיצד לסמן חומרים ספציפיים, להשתמש במיקרוסקופיה מולטי פוטוטון כדי לעזור להתבונן במיקום בתוך הרקמה, להתבונן באירועים תאיים ברקמה הבין תאית, לבצע מדידות פוטוכימיות12,13,14, ולבחון את הדינמיקה החומרית בתוך הרקמה החיה15. לדוגמה, סמן אנדותל הגידול 1 (TEM1) זוהה כסמן משטח חדשני upregulated על כלי הדם סטרומה בגידולים מוצקים רבים, סימון שבר משתנה שרשרת אחת (scFv) 78 נגד TEM1, ולאחר מכן מיקרוסקופיה multiphoton יכול לשמש עבור מיקום המנגיומה העכבר והערכה של גידולים16.
Protocol
Representative Results
Discussion
התבוננות ברקמה חיה ספציפית היא אמצעי יעיל להבנת השינויים, לוקליזציה, ואת ההשפעות הביולוגיות של החומר בתוך הרקמה17. בניסוי זה, הצעדים החשובים הם תיקון הכבד עם גוף הדמיית איברים, אשר יכול לפתור את הבעיה של חפצי תנועה עקב נשימה ופעימות לב, ושימוש במיקרוסקופ מולטי פוטון לתצפית. בשי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81772133, 81902444), הקרן למדעי הטבע גואנגדונג (2020A1515010269, 2020A1515011367), פרויקט מדעי הבריאות והטכנולוגיה של אזרח גואנגג’ואו (201803010034, 201903010072) ופרויקט החדשנות הרפואית הצבאית (17CXZ008).
Materials
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
Referências
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410 (2019).
- Werkmeister, E., et al. Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77 (2007).
- Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine. Biomed Research International. 2015, 783983 (2015).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Vogt, N. Chromatic multiphoton imaging of the whole brain. Nature Methods. 16 (6), 459 (2019).
- Bacskai, B. J., et al. Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Liu, H., et al. In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots. Nano Letters. , (2019).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
- Shear, J. B. Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry. Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Yuan, X., et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy. Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Multiphoton microscopy in biological research. Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).
