Multifoton mikroskopisk observasjon av fartøy i muslevervev

Summary

I dette eksperimentet injiseres en mus i halevenen med Rhodamine B isothiocyanate-dextran som kan flekke blodkar. Etter at leveren er utsatt og fast, kan en bestemt del av leveren velges for å observere det dype vevet i den levende kroppen ved hjelp av multifotonmikroskopi.

Abstract

Ved å observere den intravaskulære dynamikken i muselevervev, kan vi gjennomføre ytterligere grundige observasjoner og studier på vevsrelaterte sykdommer i muselever. En mus injiseres med et fargestoff som kan flekke blodårene. For å observere muslever in vivo, blir den utsatt og festet i en ramme. To og tredimensjonale bilder av blodkarene i levervevet oppnås ved hjelp av et multifotonmikroskop. Bilder av vevet på de valgte stedene er kontinuerlig anskaffet for å observere langsiktige endringer; De dynamiske endringene av blodkar i levervevet observeres også. Multifotonmikroskopi er en metode for å observere celle- og cellefunksjon i dype vevsseksjoner eller organer. Multifotonmikroskopi har følsomhet for vevmikrostruktur og muliggjør avbildning av biologisk vev ved høy romlig oppløsning in vivo, noe som gir evnen til å fange den biokjemiske informasjonen til organisasjonen. Multifotonmikroskopi brukes til å observere en del av leveren, men å fikse leveren for å gjøre bildet mer stabilt er problematisk. I dette eksperimentet brukes en spesiell vakuum sugekopp til å fikse leveren og få et mer stabilt bilde av leveren under mikroskopet. I tillegg kan denne metoden brukes til å observere dynamiske endringer av spesifikke stoffer i leveren ved å markere slike stoffer med fargestoffer.

Introduction

Blodårer kan gi næringsstoffer til ulike organvev i menneskekroppen, og utveksle stoffer. Samtidig fungerer mange cytokiner, hormoner, narkotika og celler også gjennom vaskulær transport til bestemte steder. Å observere vaskulære endringer i levervev kan bidra til å forstå fordelingen av blodstrøm i levervev og transport av stoffer, og bistå i analysen av visse vaskulære relaterte sykdommer^1,2.

Det er mange måter å observere blodkarene i leveren hos mus. Blant dem har optisk mikroskopi mange begrensninger i å observere ugjennomsiktig vaskulært vev³. Multifotonmikroskopi kan brukes til å avbilde blodkarene i levende lever med ikke-invasiv høy oppløsning⁴. Ikke bare kan tredimensjonale bilder av blodkar oppnås, men teknikken kan også brukes til å organisere vevet for å observere biologiske effekter der; Videre kan hele vevet avbildes i stedet for bare mikrovesselene som i beregnet tomografi og magnetisk resonansavbildning⁵.

Multifotonmikroskopi kan brukes til effektivt å oppdage spredte fluorescerende signaler i dypt levende vev, med mindre fototoksisitet⁶. Derfor kan aktiviteten til levende vev sikres, og mengden skade kan reduseres. Multifotonmikroskopi har bedre gjennomtrengende kraft enn konfektmikroskopi, slik at dypere lag kan observeres⁷, noe som gir unik 3D-avbildning. Multifotonmikroskopi brukes nå ofte i avbildning av kranialnerver⁸ og har blitt utvidet til studiet av nevrondynamikk hos levende mus^9,10,11.

I dette eksperimentet, etter fluorescerende merking av museblodkar, er leveren festet i en ramme, og dynamikken i blodkar i levende levervev kan ses ved hjelp av multifotonmikroskopi. Dette eksperimentet demonstrerer hvordan man markerer spesifikke stoffer, bruker multifotonmikroskopi for å observere et sted i vevet, observere cellulære hendelser i intercellulært vev, gjøre fotokjemiske^{målinger 12,13,14}, og observere materialdynamikken inne i det levende vevet¹⁵. For eksempel har tumor endotelmarkør 1 (TEM1) blitt identifisert som en ny overflatemarkør upregulert på blodkarene og stroma i mange faste svulster, markerer enkeltkjedet variabelt fragment (scFv) 78 mot TEM1, og deretter kan multifotonmikroskopi brukes til mus hemangioma plassering og evaluering av^{svulster 16}.

Protocol

All dyrepleie og prosedyrer var i samsvar med Kinas Nanfang Sykehus retningslinjer for helse og velvære (søknad Nr: NFYY-2019-73). 1. Forberedelse av mus Bedøv musen. Forbered natrium pentobarbital (50 mg/kg) i en sprøyte. Ta tak i musen (8 uker gammel mannlig C57BL / 6) med venstre hånd slik at magen vender opp og hodet er lavere enn halen. Desinfiser bukhuden med 75% alkohol. Hold sprøyten i høyre hånd, pierce magen hvit linje med nålen litt t…

Representative Results

Fordelingen av blodkar i leveren kan ses i figur 1, oppnådd ved hjelp av multifotonmikroskopi. Blodkaret er delt inn i et flertall av grener som kommer fra en koffert og fordelt til det omkringliggende rommet. Blodkarets ytre omkrets er rød, det indre hulrommet er mørkt, og det er mange ting inne. Jo klarere bildet er, jo nærmere observasjonsplanet er det. Det er også noen røde flekker rundt, sannsynligvis fordi fargestoffet trenger inn i det omkringliggende vevet for å flekke andre s…

Discussion

Å observere et bestemt levende vev er et effektivt middel for å forstå endringene, lokaliseringen og biologiske effektene av materialet inne i vevet¹⁷. I dette eksperimentet er de viktige trinnene å fikse leveren med en organavbildningsarmatur, som kan løse problemet med bevegelsesartefakter på grunn av pust og hjerteslag, og bruk av et multifotonmikroskop for observasjon. Ved hjelp av denne metoden observeres leverens indre vev in vivo gjennom et multifotonmikroskop, og blodkarene er fluore…

Materials

1 mL syringe x 2	Hunan Pinan Medical Devices Technology	YA0551
5 W heating pad	BiolinkOptics Technology	BL336
75% absolute ethanol	Guangdong Guanghua Sci-Tech	1.17113.023
Absorbent cotton ball	Healthy Sanitation Kingdom
Mouse surgical instrument	RWD Life Science	SP0001-G	Including scissors and tweezers
Multiphoton microscopy	Olympus	FV1200MPE
Organ imaging fixture	BiolinkOptics Technology	BL336	Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket
Rhodamine B isothiocyanate–Dextran	Sigma	R9379
Shaving machine	Lei Wa	RE-3201
Sodium pentobarbital	Sigma	P3761-25G