Multifoton mikroskopisk observation av kärl i muslevervävnad
Summary
I detta experiment injiceras en mus i svansen med Rhodamine B isothiocyanate-dextran som kan färga blodkärl. När levern har exponerats och fixerats kan en specifik del av levern väljas för att observera den djupa vävnaden i den levande kroppen med hjälp av multifotonmikroskopi.
Abstract
Genom att observera den intravaskulära dynamiken i muslevervävnad kan vi genomföra ytterligare djupgående observationer och studier på vävnadsrelaterade sjukdomar i muslever. En mus injiceras med ett färgämne som kan färga blodkärlen. För att observera muslever in vivo exponeras den och fixeras i en ram. Två- och tredimensionella bilder av blodkärlen i levervävnaden erhålls med hjälp av ett multifotonmikroskop. Bilder av vävnaderna på de valda platserna förvärvas kontinuerligt för att observera långsiktiga förändringar; de dynamiska förändringarna av blodkärlen i levervävnaderna observeras också. Multifotonmikroskopi är en metod för att observera cell- och cellfunktion i djupa vävnadssektioner eller organ. Multifotonmikroskopi har känslighet för vävnadsmikrostruktur och möjliggör avbildning av biologiska vävnader med hög rumslig upplösning in vivo, vilket ger möjlighet att fånga organisationens biokemiska information. Multifotonmikroskopi används för att observera en del av levern men att fixa levern för att göra bilden stabilare är problematiskt. I detta experiment används en speciell vakuumsugkopp för att fixa levern och få en stabilare bild av levern under mikroskopet. Dessutom kan denna metod användas för att observera dynamiska förändringar av specifika ämnen i levern genom att märka sådana ämnen med färgämnen.
Introduction
Blodkärl kan ge näringsämnen för olika organvävnader i människokroppen och utbyta ämnen. Samtidigt fungerar många cytokiner, hormoner, droger och celler också genom vaskulär transport till specifika platser. Observera vaskulär förändringar i levervävnad kan hjälpa till att förstå fördelningen av blodflödet i levervävnad och transport av ämnen, och hjälpa till vid analys av vissa kärlrelaterade sjukdomar1,2.
Det finns många sätt att observera leverns blodkärl hos möss. Bland dem har optisk mikroskopi många begränsningar för att observera ogenomskinlig vaskulärvävnad 3. Multifotonmikroskopi kan användas för att avbilda blodkärlen i levande lever med icke-invasiv hög upplösning4. Tredimensionella bilder av blodkärl kan inte bara erhållas, utan tekniken kan också användas för att hjälpa till att organisera vävnaden för att observera biologiska effekter däri; Dessutom kan hela vävnaden avbildas snarare än bara mikrovesselerna som i datortomografi och magnetisk resonanstomografi5.
Multifotonmikroskopi kan användas för att effektivt upptäcka spridda fluorescerande signaler i djup levande vävnad, med mindre fototoxicitet6. Därför kan levande vävnads aktivitet säkerställas, och mängden skador kan minskas. Multifotonmikroskopi har bättre genomträngande kraft än konfokal mikroskopi, vilket gör att djupare lager kanobserveras 7, vilket ger unik 3D-avbildning. Multiphotonmikroskopi används nu ofta i bildande hjärnskålen nerver8 och har utvidgats till att studera neuronal dynamik i levande möss9,10,11.
I detta experiment, efter fluorescerande märkning av mus blodkärl, levern är fixerad i en ram, och dynamiken i blodkärl i levande levervävnad kan ses med hjälp av multiphoton mikroskopi. Detta experiment visar hur man markerar specifika ämnen, använder multifotonmikroskopi för att observera en plats i vävnaden, observera cellulära händelser i den intercellulära vävnaden, göra fotokemiskamätningar 12,13,14, och observera materialdynamiken inuti den levandevävnaden 15. Till exempel har tumör endotel markör 1 (TEM1) identifierats som en ny ytmarkör uppreglerad på blodkärlen och stroma i många fasta tumörer, markera en-kedja variabel fragment (scFv) 78 mot TEM1, och sedan multiphoton mikroskopi kan användas för mus hemangioma plats och utvärdering av tumörer16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Att observera en specifik levande vävnad är ett effektivt sätt att förstå förändringar, lokalisering och biologiska effekter av materialet inutivävnaden 17. I detta experiment är de viktiga stegen att fixa levern med en organavbildningsfixtur, vilket kan lösa problemet med rörelseartefakter på grund av andning och hjärtslag och användningen av ett multifotonmikroskop för observation. Med denna metod observeras leverns inre vävnader in vivo genom ett multifotonmikroskop, och blodkä…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (81772133, 81902444), Guangdong Natural Science Fund (2020A1515010269, 2020A1515011367), Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034, 201903010072) och Military Medical Innovation Project (17CXZ008).
Materials
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
Referências
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410 (2019).
- Werkmeister, E., et al. Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77 (2007).
- Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine. Biomed Research International. 2015, 783983 (2015).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Vogt, N. Chromatic multiphoton imaging of the whole brain. Nature Methods. 16 (6), 459 (2019).
- Bacskai, B. J., et al. Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Liu, H., et al. In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots. Nano Letters. , (2019).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
- Shear, J. B. Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry. Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Yuan, X., et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy. Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Multiphoton microscopy in biological research. Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).
