O objetivo geral do protocolo é preparar mais de um milhão de gotículas femtoliter ordenadas, uniformes, estáveis e biocompatíveis em um substrato planar de 1 cm2 que pode ser usado para síntese proteica sem células.
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Artigo de método
Uma matriz de gotícula femtoliter para síntese de proteínas massivamente paralelas de moléculas de DNA único
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os avanços na resolução espacial e na sensibilidade de detecção da instrumentação científica possibilitam a aplicação de pequenos reatores para pesquisas biológicas e químicas. Para atender à demanda por microreatores de alto desempenho, desenvolvemos um dispositivo Femtoliter droplet array (FemDA) e exemplificamos sua aplicação em reações de síntese proteica livre de células massivamente paralelas (CFPS). Mais de um milhão de gotículas uniformes foram prontamente geradas dentro de uma área do tamanho de um dedo usando um protocolo de vedação de óleo de duas etapas. Cada gotícula estava ancorada em uma microcâmara femtoliter composta por um fundo hidrofílico e uma parede lateral hidrofóbica. A estrutura hidrofóbica híbrida e os óleos de vedação dedicados e surfactantes são cruciais para manter a solução aquosa femtoliter no espaço femtoliter sem perda de evaporação. A configuração femtoliter e a estrutura simples do dispositivo FemDA permitiram o consumo mínimo de reagentes. A dimensão uniforme dos reatores de gotículas tornou as medições quantitativas e de curso de tempo em larga escala convincentes e confiáveis. A tecnologia FemDA correlacionou o rendimento proteico da reação do CFPS com o número de moléculas de DNA em cada gotícula. Agilizamos os procedimentos sobre a microfabização do dispositivo, a formação das gotículas femtoliter e a aquisição e análise dos dados de imagem microscópica. O protocolo detalhado com o baixo custo otimizado de execução torna a tecnologia FemDA acessível a todos que possuem instalações padrão de limpeza e um microscópio de fluorescência convencional em seu próprio lugar.
Introdução
Pesquisadores usam reatores para realizar reações bioquím químicas. Há esforços significativos que têm sido feitos para reduzir o tamanho do reator e aumentar o rendimento experimental, a fim de diminuir o consumo de reagentes e, ao mesmo tempo, melhorar a eficiência do trabalho. Ambos os aspectos visam libertar os pesquisadores de uma carga de trabalho pesada, diminuindo o custo e acelerando a pesquisa e o desenvolvimento. Temos um roteiro histórico claro sobre o desenvolvimento das tecnologias do reator do ponto de vista dos volumes de reação e do throughput: bicos únicos/frascos/tubos de ensaio, tubos mililitros, tubos microliteres, microliter 8-tube tiras, microli....
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Protocolo
1. Microfabricação do substrato de matriz de microcrobra femtoliter
NOTA: Realize o seguinte experimento de microfabização em uma sala de limpeza. Use luvas e um terno de limpeza antes de entrar na sala de limpeza.
- Substrato de vidro de cobertura de limpeza
- Coloque o vidro da tampa em um rack de coloração de vidro de cobertura. Sonicar o vidro de cobertura em hidróxido de sódio de 8 M (NaOH) por 15 min a temperatura ambiente (RT).
ATENÇÃO: O NaOH em altas concentrações é altamente perigoso para a pele e os olhos. Manuseie-o suavemente sem qualquer respingo. - Tire o rack da solução NaOH e enxágue o vidro de cob....
- Coloque o vidro da tampa em um rack de coloração de vidro de cobertura. Sonicar o vidro de cobertura em hidróxido de sódio de 8 M (NaOH) por 15 min a temperatura ambiente (RT).
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Resultados
O processo de microfabricação consiste em limpeza de substratos, funcionalização de superfície, revestimento CYTOP, fotolitografia, gravura a seco, despojo fotoresist e limpeza final. É importante ressaltar que o protocolo apresentado permitiu a remoção completa do polímero CYTOP hidrofóbico dentro dos microchambers Figura 3A, produzindo uma estrutura hidrofóbica-hidrofóbica altamente paralela em um substrato de vidro de cobertura padrão. Com o auxílio do protocolo de vedação de óleo, verifi.......
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Discussão
A medição altamente quantitativa baseada nas gotículas altamente uniformes, estáveis e biocompatíveis no FemDA possibilitou a distribuição discreta, a característica única do nosso estudo diferente das outras. Otimizamos sistematicamente e detalhamos os processos de microfabização e formação de gotículas neste artigo. Existem várias etapas críticas no protocolo estabelecido.
Primeiro, o revestimento uniforme do polímero CYTOP altamente viscoso no substrato de vidro fino retangular determina em.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo número de subvenção JSPS KAKENHI JP18K14260 e pelo orçamento da Agência japonesa de Ciência e Tecnologia da Terra Marinha. Agradecemos a Shigeru Deguchi (JAMSTEC) e Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) por fornecerem as instalações de caracterização. Agradecemos a Ken Takai (JAMSTEC) pelo suporte a software comercial. A microfabização foi realizada na Supercleanroom Takeda Sentanchi, a Universidade de Tóquio, apoiada pelo "Programa plataforma de nanotecnologia" do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia (MEXT), Japão, Número de Subvenção JPMXP09F19UT0087.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| (3-aminopropil)trietoxissilano | |||
| 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| 2-propanol | Kanto Chemical | EL grau | EL: para uso eletrônico. |
| Microscópio confocal de varredura a laser 3D | Lasertec | OPTELICS HYBRID | Outros microscópios semelhantes (por exemplo, Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) também são aplicáveis. |
| Seringa de 50 mL | Terumo | SS-50LZ | |
| 6,8-difluoro-4-metilumbelliferil fosfato | Thermo Fisher Scientific | D6567 | Prepare uma solução estoque de 5 mM em dimetilsulfóxido |
| Acetona | Kanto Chemical | EL grau | EL: para uso eletrônico. Pureza 99,8%. |
| Soprador de ar | Hozan | Z-263 | |
| Bloco de alumínio | BIO-BIK | AB-24M-02 | |
| Suporte de microtubo de alumínio | BIO-BIK | AB-136C | |
| ASAHIKLIN AE-3000 | AGC | (amostra de teste) | A amostra de teste grátis pode estar disponível mediante consulta à AGC. |
| Limpador BEMCOT PS-2 | Ozu | 028208 | |
| Punção de biópsia com êmbolo | Kai | BPP-10F | |
| Vidro de cobertura | Matsunami Glass | No. 1 (24 mm e vezes; 32 mm, 0,13 ~ 0,17 mm de espessura) | Tamanho personalizado. |
| Porta-manchas de vidro | Nakayama | 803-131-11 | |
| CRECIA TechnoWipe limpador limpo | Nippon Crecia | C100-M | |
| Tapete de corte | GE Healthcare | WB100020 | |
| CYTOP | AGC | CTL-816AP | |
| Misturador de desaeração | Thinky | AR-100 | |
| Cortador de mesa | Roland | STIKA SV-8 | |
| Desenvolvedor | AZ Electronic Materials | AZ 300 MIF | AZ Electronic Materials foi agora adquirida pela Merck. Outros desenvolvedores alcalinos também podem ser aplicáveis, mas devem exigir otimização das condições de desenvolvimento (tempo, temperatura, etc.) |
| Fita adesiva dupla face de filme Kapton | Teraoka Seisakusho | 7602 #25 | |
| Etanol | Kanto Químico EL | grau | EL: para uso eletrônico. Pureza 99,5%. |
| Versão de Fiji | : ImageJ 1.51n | ||
| Cortador de cabo plano | Tokyo-IDEAL | MT-0100 | |
| Óleo Fomblin | Solvay | Y25 ou Y25 / 6 | A amostra de teste grátis pode estar disponível mediante consulta à Solvay. Fomblin Y25 / 6 é uma alternativa se Y25 não estiver prontamente disponível. |
| Placa quente | COMO UM | TH-900 | |
| Agulha de injeção | Terumo | NN-2270C | 22G × 70 mm |
| Microscópio de fluorescência invertida | Nikon | Eclipse Ti-E | Especificação de epifluorescência, câmera CCD ou sCMOS, palco motorizado, sistema de foco automático e lente objetiva de alta NA são necessários. |
| KaleidaGraph | Synergy | Versão: 4.5 | |
| Alinhador de máscara | SUSS | MA-6 | Outros alinhadores de máscara também são aplicáveis, desde que o modo de contato a vácuo esteja disponível. |
| Pipeta MICROMAN | GILSON | E M250E | Ponta do pistão capilar: CP250 |
| Microsoft Excel | Versão Microsoft | : 16.16.15 | |
| Mini câmara de vácuo | COMO UM | MVP-100MV | |
| Água livre de nuclease | NIPPON GENE | 316-90101 | |
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Tubo de PCR | NIPPON Genetics | FG-021D/SP | |
| PLACA DE Petri | AS ONE | GD90-15 | Diâmetro 90 mm, altura 15 mm. |
| Photoresist | AZ Electronic Materials | AZ P4903 | A AZ Electronic Materials foi agora adquirida pela Merck. AZ P4620 é uma alternativa. |
| Leitor de placas | BioTek | POWERSCAN HT | |
| Luvas de polietileno | AS ONE | 6-896-02 | Nome comercial: Saniment. |
| Kit de síntese de proteínas in vitro PURExpress | New England Biolabs | E6800S ou E6800L | Para reação de síntese de proteínas sem células. |
| Sistema de gravação de íons reativos | Samco | RIE-10NR | Outros sistemas RIE também são aplicáveis, mas devem exigir a otimização das condições RIE (vazão de gás, pressão da câmara, potência de RF, tempo de gravação, etc.) |
| Inibidor de RNase | New England Biolabs | M0314S | |
| Fita adesiva | 3M | 810-1-18D | |
| Solução de hidróxido de sódio | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-09575 | Concentração de 8 M; perigo. |
| Revestidor de rotação | Oshigane | SC-308 | |
| SURFLON S-386 surfactante | AGC | (amostra de teste) | A amostra de teste grátis pode estar disponível mediante consulta à AGC. |
| Elastômero de silicone SYLGARD 184 | Dow | Sylgard184 | Composição química: polidimetilsiloxano. A proporção de mistura padrão é base: agente de cura = 10 : 1 (m/m). |
| Pinça | Ideal-tek | 2WF. SA.1 2A | |
| Limpador ultrassônico | AS ONE | ASU-2M | |
| Mandril a vácuo | Oshigane | (Personalizado) | Material: delrin; estágio de amostra retangular com vários furos (48 furos, cada um com 1 mm de diâmetro); o tamanho é personalizado para caber no tamanho da lamínula (24 mm e vezes; 32 mm). |
Referências
- Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).
- Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).
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Reimpressões e permissões
