מערך מערכת Droplet ליטר ליצירת חלבון מקבילי בנפט ממולקולות דנ א יחיד
Summary
המטרה הכוללת של הפרוטוקול היא להכין מעל 1,000,000 הורה, אחיד, יציב, ותואם ביולוגי טיפות של ליטר על 1 ס מ2 מצע מישורי שניתן להשתמש בו עבור סינתזה של חלבון תא ללא.
Abstract
ההתקדמות ברזולוציה מרחבית ורגישות האיתור של מכשור מדעי מאפשרים ליישם כורים קטנים למחקר ביולוגי וכימי. כדי לענות על הביקוש למכשירים בעלי ביצועים גבוהים, פיתחנו מערך מיקרוליטר של המכשיר (מכשיר “פרמי”) ולמעשה היישום שלה באמצעות סינתזה של חלבון מקביל בנפט ללא מקבילים (CFPS) תגובות. מעל 1,000,000 טיפות מדים שנוצרו בקלות בתוך שטח בגודל אצבע באמצעות פרוטוקול איטום שני צעדים שמן. כל droplet עגנה בתוך חדר מיקרו-ליטר שמורכב מתחתית הידרופילי ומקיר צדדי הידרופובי. היברידית הידרופיפילית-in-הידרופובי מבנה ושמני איטום ייעודי והרב הם חיוניים עבור שמירה באופן שטחי הפתרון המימית ליטר בחלל ליטר ללא אובדן אידוי. תצורת הפליטר והמבנה הפשוט של המכשיר הינו מותר לצריכה מזערית. המימד האחיד של כורי ה-droplet הכין מדידות כמותית ומדידה בקנה מידה גדול משכנע ואמין. הטכנולוגיה הנשית מתאם את תפוקת החלבון של תגובת CFPS עם מספר מולקולות ה-DNA ב-droplet כל. אנו מתקנים את ההליכים לגבי המיקרו-בנייה של המכשיר, היווצרות טיפות ליטר, ורכישה וניתוח של נתוני התמונה המיקרוסקופיים. הפרוטוקול המפורט עם עלות הריצה הנמוכה והממוטב הופך את טכנולוגיית הטכנולוגיה הממוטבת לנגישה לכל מי שיש לו מתקני חדר נקי סטנדרטיים ומיקרוסקופ של זריחה קונבנציונאלית במקום שלהם.
Introduction
החוקרים משתמשים בכורים כדי לבצע תגובות ביו/כימיות. ישנם מאמצים משמעותיים שנעשו כדי להקטין את גודל הכור ולהגדיל את התפוקה הניסיונית כדי להקטין את צריכת הדלק תוך שיפור יעילות העבודה. שני ההיבטים מכוונים לשחרור חוקרים מעומס עבודה כבד, הפחתת העלות והאצת המחקר והפיתוח. יש לנו מפת דרכים היסטורית ברורה על פיתוח טכנולוגיות הכור מנקודת המבט של אמצעי התגובה ותפוקה: כוסות יחיד/בקבוקון/מבחן-צינוריות, צינורות מיליליטר, צינורות מיקרוליטר, מיקרוליטר 8-שפופרת, מיקרוליטר 96/384/1536-באר צלחת, ו מיקרופלואידיק/picoliter/פיאוליטר/כורים ליטר1,2,3,4,5,6,7. מקבילה לצמצום גודל התכונה של טרנזיסטורים על שבבי מעגלים משולבים בתעשיית מוליכים למחצה בעשורים האחרונים, ביו/כימי מיקרוקטורים עוברים הפחתת עוצמה ואינטגרציה מערכת. כלים קטנים כאלה השפיעו מאוד על הביולוגיה הסינתטית של התאים או על התאים, ביולוגיה סינתטי, ובדיקת אבי-טיפוס בתפוקה גבוהה והקרנת8,9,10,11,12. נייר זה מתאר את המאמצים האחרונים שלנו על פיתוח של טכנולוגיית מערך droplet ייחודי ומדגים את יישומו ב-CFPS13, טכנולוגיה יסודית לביולוגיה סינתטית וקהילות סינון מולקולריות14. בפרט, אנו מספקים במכוון פרוטוקול מיטבי ובעלות נמוכה כדי להפוך את ההתקן הניתן לגישה של התקן החיצוני לכולם. בעלות נמוכה וקל לטפל פרוטוקול המכשיר המזעור יתרום למטרות חינוכיות של אוניברסיטאות ולעזור להפיץ את הטכנולוגיה.
מכינה לנשים טיפות של ליטר בצפיפות גבוהה של 106 לכל 1 ס מ2 על מצע זכוכית מישורי. אנו מצופים פולימר הידרופובי, CYTOP15, על מצע זכוכית חרוט סלקטיבי (הוסר) cytop במיקומים מוגדרים מראש כדי ליצור מערך מיקרוקאמריים על מצע. לפיכך, המיקרו-חדר המתקבל מורכב מקיר צדדי הידרופובי (CYTOP) ומתחתית הידרופילי (זכוכית). כאשר זורמים באופן רציף מים ושמן על פני השטח עם תבנית, המים יכולים להיות לכודים ואטומים לתוך המיקרותאי. מבנה ההידרופיפילית-בהידרופובי חיוני למים מחוץ למיקרוצ’יימברס, בידוד שחקנים בודדים, ושמירה על תמיסה זעירה ומימית בתוך החלל הפטויטר. המאפיין הייחודי הוחל בהצלחה על הכנת טיפות מים בשמן מיקרו מיקרוליפיד16,17. בהשוואה למכשיר אב טיפוס16, אנחנו הראשונים אופטימיזציה תהליך מיקרוייצור כדי להגשים הסרה מלאה של פולימר cytop, כמו גם חשיפה מלאה של התחתון זכוכית. CYTOP הוא מfluoropolymer מיוחד הכולל מתח נמוך מאוד בפני השטח (19 mN/m) נמוך יותר מזה של חומרים קונבנציונליים מיקרוריאקטור כגון זכוכית, פלסטיק, סיליקון. שלה טוב אופטי, חשמל, ביצועים כימיים כבר נוצל טיפול פני השטח של התקנים microflu,18,19,20,21,22,23,24. במערכת נשית, כדי להשיג הרטבה טובה של השמן על פני CYTOP, מתח פני השטח של הנפט חייב להיות נמוך יותר מאשר המשטח המוצק25. אחרת, השמן הנוזלי במגע עם המשטח המוצק נוטה להיות כדורי במקום להתפשט על פני השטח. חוץ מזה, מצאנו כי כמה שמנים ביולואורופחמן פופולריים (g., 3M FC-40)16 ו הידרופלואורואואתר שמנים (למשל, 3m הסדרה novec) יכול לפזר cytop כתוצאה של מורפולוגיה אמורפיות של cytop, אשר קטלנית למדידה כמותית יהיה מפוקפק במונחים של זיהום בין טיפות. למרבה המזל, זיהינו שמן ביולוגי תואם וידידותי לסביבה מפגין נמוך יותר (< 19 mN/m) מתח פני השטח13. כמו כן מצאנו מסורסטנט חדש שיכול להתמוסס בשמן שנבחר ולתפקד בריכוז נמוך (0.1%, לפחות 10 מקפלים נמוך יותר מאשר דיווחו26בעבר הפופולריים 26,27)13. ניתן לייצב את ממשק המים/הנפט שנוצר על ידי הגולש. בגלל שיעור האידוי הגבוה של השמן, בעקבות הסומק עם השמן, התחלנו עוד שמן ביולוגי תואם וידידותי לסביבה להחליף את הראשון לאטום את המיקרוצ’יימברס. אנו מכנים את השמן הראשון (אסייקלין AE-3000 עם 0.1 wt x SURFLON S-386) “שמן הריקון” ואת השמן השני (פומעבלין Y25) “שמן איטום”, בהתאמה.
אסטרטגיית איטום השמן בשני השלבים מסוגלת לממש היווצרות מחזק של מערך ה-droplet של הנשים בתוך דקות ובלי מכשור מתוחכם. בשל בעיית האידוי, הוא נחשב מאתגרת ליצור מיקרואורנים קטנים יותר מאשר picoliter כרכים28. בעיה זו התייחסה לבעיה זו באופן שיטתי מיטוב החומרים והתהליכים המשמשים להכנת מיקרוקטורים/טיפות. כמה מאפיינים ראויים לציון של הטיפות כתוצאה מכך כוללים אחידות גבוהה (או מונוטוני), יציבות, וביותאימות בקנה מידה של ליטר. מקדם הווריאציה (CV) של כרך ה-droplet הוא רק 3% (ללא תיקון כהות לתמונות מיקרוסקופיים), קורות החיים הקטנים ביותר בין פלטפורמות ה-droplet בעולם, המבטיח מדידה מקבילה וכמותית מאוד. ה-droplet הנשית הינה יציבה לפחות 24 שעות ללא זיהום בקרב טיפות בטמפרטורת החדר, שהיא רבת ערך עבור מדידה אמינה בזמן הקורס. בנוגע לביו-תאימות, הצלחנו לסנתז חלבונים שונים מהדנ א של תבנית בעלת עותק יחיד ב-droplet של ליטר, שנחשבה בעבר לקשה או לא יעילה29,30. זה יהיה ראוי להבהיר מדוע חלבונים מסוימים המסוגלים להיות מסונתז בתוך הנשים לא יכול להיות מסונתז במערכות droplet אחרות. היא לא הייתה רק התקדמות טכנית, אלא גם הבינה מדידה כמותית unprecedentedly שיכולה לתאם את תפוקת החלבון (כפי שהיא משתקפת בעוצמת הקרינה של ה-droplet) למספר מולקולות ה-DNA של תבנית ב-droplet. כתוצאה מכך, ההיסטוגרמה של העוצמה הפלואורסצנטית של טיפות מ-CFPS מבוסס-הראה התפלגות בדידה שניתן להתאים בצורה יפה על-ידי סכום של הפצות גאוס במרווחים שווים של שיא לשיא. יתר על כן, ההסתברות של התרחשות של טיפות המכילות מספרים שונים של מולקולות DNA היה התאמה מושלמת התפלגות פואסון31. לכן, ניתן לנרמל את תפוקת החלבון השונה בכל droplet בהתבסס על ההתפלגות הדיסקרטית. תכונה קריטית זו מאפשרת לנו להפריד בין מידע הפעילות האנזימטי לבין העוצמה הנראית לעין, שעדיין לא היתה זמינה עם פלטפורמות אחרות של מיקרומושחקנים. מערכות מיון של תא מיקרופלואידיג קיימים מיומנים במיון אוטומטי לחלוטין וטוב להתרכז בדגימות, אך לעתים ניתן ליצור פלט של היסטוגרמה רחבה או ארוכת זנב יחסית בהיבט האנליטי32,33. שלנו מערכת נשית מאוד כמותית ותואמת סתיימים קובע בחינת ביצועים חדשה ותקן אנליטי גבוה בתחום התפתחות מיקרוריאקטור.
השמנים והחומרים שניתן להשתמש בהם להכנת טיפות הם עדיין מאוד מוגבל34. השילוב של אסהיקלין AE-3000 ו SURFLON S-386 הוקמה בשנת החברה הוא חבר חדש של ארסנל גדל של הממשק הפיזיוכימי בין השלב מימית ובשלב הנפט13. הממשק החדש של למעשה הוא יציב פיזית, מבחינה כימית, ותואם ביולוגית עם תמלול, תרגום ומכונות שינוי פוסט-טרנסלליות עבור סוגים רבים של חלבונים13. זה יהיה מאוד אטרקטיבי למצוא חלבון שלא ניתן לסינתזה בהגדרות ה-droplet במקום. חוץ מזה, החיסכון בעלויות של ריאגנטים הוא ברור יותר במערכת droplet ליטר של הרבה יותר מאשר ב nanoliter ו picoliter הכור מערכות35,36. במיוחד, לעתים קרובות יהיה נפח מת גדול, אשר נגרמת בעיקר על ידי צינורות או אספקה חיצונית, במערכות מיקרופלואידיג מערכות הדור, אבל לא ב-שלנו הנשים. תבנית המערך מעדיפה גם על-ידי אפיון מיקרוסקופי חוזר ומפורט (בדומה לניתוח התוכן הגבוה שנקרא) עבור כל המגיב היחיד37, ולא רק תמונה אחת עבור אובייקט הנע מהיר. בקנה מידה של ליטר מאופשר שילוב של מעל 1,000,000 כורים על האזור בגודל אצבע, בעוד מספר זהה של כורים nanoliter (אם הוא קיים) דורש מעל שטח מרובע, אשר יהיה ללא ספק לייצר או להשתמש במערכת כגון.
Protocol
Representative Results
Discussion
המדידה הכמותית ביותר המבוססת על הטיפות האחידה, היציבות והביו-מתאימות באמצעות החלוקה הדיסקרטית, מאפשרת את ההפצה הנפרדת, התכונה הייחודית של המחקר שלנו שונה מאחרים. באופן שיטתי אופטימיזציה והפרטים את תהליכי היווצרות המיקרוייצור ו-droplet בנייר זה. קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול המבוסס.
…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי JSPS KAKENHI גרנט מספר JP18K14260 ואת התקציב של הסוכנות היפנית עבור מדעי הארץ ימית וטכנולוגיה. אנו מודים לשייגרו דגוצ’י (JAMSTEC) ו Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) למתן מתקני אפיון. אנו מודים לקן Takai (JAMSTEC) עבור תמיכה בתוכנה מסחרית. המיקרו-הייצור נערך ב-“טקדה”, האוניברסיטה של טוקיו, הנתמכת על-ידי “תוכנית הטכנולוגיה הטכנולוגית” של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה (MEXT), יפן, גרנט מספר JPMXP09F19UT0087.
Materials
| (3-aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| 2-propanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. |
| 3D laser scanning confocal microscope | Lasertec | OPTELICS HYBRID | Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable. |
| 50 mL syringe | Terumo | SS-50LZ | |
| 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate | Thermo Fisher Scientific | D6567 | Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide |
| Acetone | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.8%. |
| Air blower | Hozan | Z-263 | |
| Aluminum block | BIO-BIK | AB-24M-02 | |
| Aluminum microtube stand | BIO-BIK | AB-136C | |
| ASAHIKLIN AE-3000 | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
| BEMCOT PS-2 wiper | Ozu | 028208 | |
| Biopsy punch with plunger | Kai | BPP-10F | |
| Cover glass | Matsunami Glass | No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) | Size-customized. |
| Cover glass staining rack | Nakayama | 803-131-11 | |
| CRECIA TechnoWipe clean wiper | Nippon Paper Crecia | C100-M | |
| Cutting mat | GE Healthcare | WB100020 | |
| CYTOP | AGC | CTL-816AP | |
| Deaeration mixer | Thinky | AR-100 | |
| Desktop cutter | Roland | STIKA SV-8 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 300 MIF | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.) |
| Double-coated adhesive Kapton film tape | Teraoka Seisakusho | 7602 #25 | |
| Ethanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.5%. |
| Fiji | Version: ImageJ 1.51n | ||
| Flat-cable cutter | Tokyo-IDEAL | MT-0100 | |
| Fomblin oil | Solvay | Y25, or Y25/6 | Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available. |
| Hot plate | AS ONE | TH-900 | |
| Injection needle | Terumo | NN-2270C | 22G × 70 mm |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required. |
| KaleidaGraph | Synergy | Version: 4.5 | |
| Mask aligner | SUSS | MA-6 | Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable. |
| MICROMAN pipette | GILSON | E M250E | Capillary piston tip: CP250 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Version: 16.16.15 | |
| Mini vacuum chamber | AS ONE | MVP-100MV | |
| Nuclease-free water | NIPPON GENE | 316-90101 | |
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PCR tube | NIPPON Genetics | FG-021D/SP | |
| Petri dish | AS ONE | GD90-15 | Diameter 90 mm, height 15 mm. |
| Photoresist | AZ Electronic Materials | AZ P4903 | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative. |
| Plate reader | BioTek | POWERSCAN HT | |
| Polyethelene gloves | AS ONE | 6-896-02 | Trade name: Saniment. |
| PURExpress in vitro protein synthesis kit | New England Biolabs | E6800S or E6800L | For cell-free protein synthesis reaction. |
| Reactive-ion etching system | Samco | RIE-10NR | Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.) |
| RNase inhibitor | New England Biolabs | M0314S | |
| Scotch tape | 3M | 810-1-18D | |
| Sodium hydroxide solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-09575 | 8 M concentration; danger. |
| Spin coater | Oshigane | SC-308 | |
| SURFLON S-386 surfactant | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
| SYLGARD 184 silicone elastomer | Dow | Sylgard184 | Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m). |
| Tweezers | Ideal-tek | 2WF.SA.1 2A |
|
| Ultrasonic cleaner | AS ONE | ASU-2M | |
| Vacuum chuck | Oshigane | (Customized) | Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm). |
Referências
- Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).
- Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).
- Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab on a Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
- Zhu, P. A., Wang, L. Q. Passive and active droplet generation with microfluidics: a review. Lab on a Chip. 17 (1), 34-75 (2017).
- Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
- Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 46 (11), 114004 (2013).
- Zhang, Y., Jiang, X., Fan, C. Microfluidic tools for DNA analysis. DNA Nanotechnology. , 113-153 (2013).
- Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks. Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).
- Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics. Genes. 9 (3), (2018).
- Lee, K. H., Kim, D. M. Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments. Biotechnology Journal. 8 (11), 1292-1300 (2013).
- Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology. Micromachines. 10 (5), (2019).
- Bowman, E. K., Alper, H. S. Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications. Trends in Biotechnology. , (2019).
- Zhang, Y., et al. Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array. Science Advances. 5 (8), 8185 (2019).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. , (2019).
- Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (10), 104011 (2008).
- Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array. Lab on a Chip. 10 (24), 3355-3362 (2010).
- Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nature Communications. 5, 4519 (2014).
- Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels. Journal of Vacuum Science & Technology B. 28 (4), 729-735 (2010).
- Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides. Optics Express. 21 (1), 698-709 (2013).
- Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).
- Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films. Journal of Colloid and Interface Science. 303 (2), 517-524 (2006).
- Lin, Y. Y., et al. Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators. Sensors and Actuators B-Chemical. 150 (1), 465-470 (2010).
- Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab on a Chip. 8 (5), 741-746 (2008).
- Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis. Chemistry-a European Journal. 24 (46), 12078-12083 (2018).
- de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Reviews of Modern Physics. 57 (3), 827-863 (1985).
- Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
- Wagner, O., et al. Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants. Lab on a Chip. 16 (1), 65-69 (2016).
- Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
- Mazutis, L., et al. Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis. Analytical Chemistry. 81 (12), 4813-4821 (2009).
- Galinis, R., et al. DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (9), 3120-3123 (2016).
- Zhang, Y., Noji, H. Digital bioassays: theory, applications, and perspectives. Analytical Chemistry. 89 (1), 92-101 (2017).
- Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
- Courtois, F., et al. An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets. ChemBioChem. 9 (3), 439-446 (2008).
- Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
- Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4004-4009 (2010).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
- Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology. Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).
- Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Mukhopadhyay, R. When PDMS isn’t the best. Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
- Bradshaw, R. A., et al. Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (6), 3473-3477 (1981).
- Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C., Conn, P. M. Volume measurements in confocal microscopy. Techniques in Confocal Microscopy. , 143-162 (2010).
- Noji, H. Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array. The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. , 630-632 (2013).
- Zhang, Y., et al. Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays. Analytical Methods. 4 (10), 3466-3470 (2012).
- Zhang, Y., et al. Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays. Biomicrofluidics. 7 (3), 034110 (2013).
- Gonzalez, R. C., Woods, R. E. . Digital image processing. , (2018).
- Cohen, L., Walt, D. R. Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 345-363 (2017).
