여기서 우리는 B 세포에 견인력 현미경 실험을 수행하는 데 사용되는 프로토콜을 제시한다. 우리는 연약한 폴리 아크릴아미드 젤의 준비와 그 기능성, 현미경에서의 데이터 수집 및 데이터 분석의 요약을 설명합니다.
견인력 현미경 검사법(TFM)은 기판에 세포에 의해 생성된 힘의 측정을 가능하게 한다. 이 기술은 탄성 기판을 당기는 세포에 의해 생성된 실험적으로 관찰된 변위 필드에서 견인력 측정을 추론합니다. 여기서, 우리는 B 세포 수용체의 항원 참여에 의해 활성화될 때 B 세포에 의해 가해지는 힘 필드의 공간 및 측두구조를 조사하기 위해 TFM을 조정하였다. 겔 강성, 비드 밀도 및 단백질 기능화는 세포 표면 수용체를 위한 리간드에 특별히 반응하는 상대적으로 작은 세포(~ 6 μm)의 연구에 최적화되어야 합니다.
B 세포는 면역 계통의 항체 생성 세포입니다. 적응성 면역 반응을 활성화하기 위해, 그들은 먼저 B 세포 수용체 (BCR)1에게불린 특정 수용체를 통해 네이티브 양식 (즉, 비 처리)에서 항원을 취득한다. 이 과정은 림프절 B 세포 영역에서 발생합니다. 일부 항원림프액을 통해 B 세포에 도달할 수 있더라도, 대부분의 항원, 특히 높은 분자량(림프도관의 한계 크기인 70 kDa)은 실제로 항원 제시 세포(APC)의 표면에 그들의 모국형태로 제시되고, 일반적으로 캡슐 성 대식세포 또는 모낭 세포(fctin) 또는 말낭 세포(fcs) 특이적 세포를 통해 서술하였다. 이 세포와의 접촉은 BCR이 APC 관련 항원에서 힘을 발휘하는 면역 시냅스의 형성으로 이어집니다. BCR에 항원의 결합은 BCR 신호를 개시, 이는 힘 생성 메커니즘을 활성화 할 수 있습니다. 이러한 힘은 BCR 신호를 증폭하는 데 중요할 수 있지만 B 세포가 항원을 추출한 다음 내재화하는 데도 필수적입니다.
최근 연구에 따르면 BCR은 실제로메카노감2입니다. 예를 들어, 딱딱한 기판은 향상된 BCR 신호3을유도합니다. 더욱이, 면역 시냅스에서 생성된 힘은 단일 BcR에서 항원에 대한 친화성을 조사하고 이를 통해 친화력 차별4를보장한다. 따라서 항원 프리젠 테이션에 B 세포의 기계적 반응을 조사하고 이 반응을 연루 된 수용체 유형 (IgG/IgM)5,접착 분자 (인테그린 리간드) 또는 약리학적 및 유전자 변형 세포 (즉, BCR 신호 사이토 의 역학적 또는6)하류의 단백질 하류의 질질에 대해 이 반응을 해부하는 것은 흥미롭습니다.
생리적 강성의 기판에 대한 세포의 반응을 관찰하는 간단한 방법은, 동시에 기판에 가해지는 연구력은 견인력 현미경검사법(TFM)이다. TFM은 탄성 기판을 당기는 세포에 의해 생성된 변위 필드를 관찰하는 것으로 구성된다. 원래 겔의 변형은 위상 대비 현미경검사법 7에의해 흉골 자체의 주름을 통해 관찰되었지만, 형광 마이크로비드를 수탁마커로 삽입하여 더 나은 분해능을 허용하고 이후 표준8이되었다. 이 방법은 부착 세포, 조직, 심지어 젤에 내장 된 오르가노이드에 의해 가해지는 견인력을 조사하는 데 사용되었습니다. TFM의 여러 변형은TIRF 현미경검사법(12)을허용하기 위해 젤의 굴절지수 변형, 나노 인쇄패턴(13)에의해 구슬을 대체하고, 평평한표면(14)대신 나노필라를 사용하는 등, 과해상도 현미경검사(즉, STED10 또는 SRRF11)와결합하여 9개개발되었다. 이러한 변형에 대한 전체 검토는 콜린 요크 외15를참조하십시오.
여기에 제시된 프로토콜은 항원 코팅 기판에 B 세포에 의해 가해지는 힘을 측정하는 절차를 설명합니다. 이들 힘은 리간드(antigen)에 적용되어 이를 클러스터링하고 그 후 항원 제시 기판으로부터 추출한다. 우리는 생리항원 제시 기질의 강성, B 세포에 대한 크기 및 관련 코팅의 강성을 모방하기 위해 표준 TFM 프로토콜을 조정했습니다. 이 프로토콜은 동시에 여러 세포의 연구를 허용하고 형광 현미경 기술 및 화학 적 치료와 함께 사용할 수 있습니다. 그러나, 광학핀셋(16),분자 장력프로브(17,18),생체멤브레인프로브(19)및 원자력현미경(20)이 더 적합한 기술인 단일 분자 힘 측정을 조사하는 것을 목표로 하지 않는다. TFM은 다른 단일 세포력 측정 방법(예를 들어, 마이크로피펫 21 또는마이크로플레이트(22)과비교하여 ~300nm의 해상도로 시냅스에서 가해지는 힘의 완전한 맵을 재구성할 수 있게 한다. 이것은 표면에 가해지는 힘에 있는 주걱 측두패턴을 확인하고, 젤이 공초점 화상 진찰과 호환되기 때문에, 특정 단백질의 모집과 그(예를 들어, 사이토스켈레톤 및 신호 단백질)의 모집과 상관관계를 관련시키는 것이 유용하다.
3D TFM은 가능하지만 사용된 강성 및 설정과 호환되지 않습니다. 3D의 변형은 돌출력 현미경검사(AFM스캐닝 세포가 도금되는 변형형 멤브레인)과 같은 다른 보다 복잡한 설정에 의해 달성가능하며,23,24 및 탄성 공진기 간섭 응력 현미경검사(ERISM, 젤은 빛을 위한 공명 캐비티 역할을하고, 나노계 의정확도로 기체의 변형을 강조하는 젤). 이 기술은 아주 유망하더라도, 그(것)들은 아직 B 세포에서 채택되지 않았습니다. 나노 기둥(14)과같은 다른 유형의 TFM은 더 재현 가능한 기판을 갖는 데 사용될 수 있습니다. 그러나, 이 형상은 세포가 분석을 복잡하게 하는 기둥을 관통하기 때문에 연약한 세포에 적응되지 않습니다. 이 접근법은 실제로기둥(26)을중심으로 구조물을 구축하는 세포의 능력을 관찰하기 위해 T 세포에서 사용되었습니다.
단순함에도 불구하고, 폴리 아크릴아미드 젤을 사용하는 TFM은 많은 세포의 동시 관찰을 허용하고 벤치와 에피플루오렌스 현미경이 장착 된 모든 실험실에서 쉽고 저렴하게 구현 될 수 있습니다 (우리는 공초점 / 회전 디스크를 권장하지만).
APC의 생리적 강성을 모방하기 위해 ~ 500 Pa27의 강성을 가진 폴리 아크릴아미드 젤을 사용하고 항원 활성화로 젤을 기능화했습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 암탉 계란 리소지메 (HEL)와 폴리 아크릴 아미드 젤의 표면을 기능화. 이를 통해 항원 결합 부위의 교전을 통해 BCR의 자극에 의해 생성된 힘을 측정할 수 있다. MD4 마우스로부터 이러한 항원 및 HEL 특이적 B 세포의 사용은 항원결찰(28)에반응하여 상대적으로 균일한 힘 생성을 보장한다. 그러나, 다른 분자(예: B6 마우스에 대한 안티-IgM)는 겔상에 이식될 수 있지만, 이러한 경우에 생성된 힘은 더 이질적이고 덜 강렬할 수 있다. B 셀은 작은 세포 (직경 ~6 μm) 때문에 구슬의 수는 최대하지만 여전히 추적 할 수 있도록 최적화되었습니다. 기판에 ~kPa 힘을 발휘하는 큰 세포의 경우, 상대적으로 희소한 구슬을 사용하거나 변형 필드를 재구성하기 위해 간단한 입자 이미지 속도 측정(PIV)을 수행하여 만족스러운 결과를 얻을 수 있다. 그러나, ~50Pa만큼 작은 응력을 발휘하는 B 림프구와 같은 작은 세포의 경우, 변형 필드를 재구성할 때 원하는 정확도를 달성하기 위해 단일 입자 추적(입자 추적 속도, PTV)의 사용이 요구된다. 구슬을 개별적으로 안정적으로 추적하려면 객관적인 렌즈의 배율은 최소 60배 이상이어야 하며 수치 조리개는 약 1.3이어야 합니다. 따라서, 젤은 상대적으로 얇은 (&50 μm) 여야 하며, 그렇지 않으면 비드가 목표의 작업 거리 이상으로 보이지 않는다.
주요 프로토콜은 젤 제제, 젤 기능화 및 이미징의 세 가지 섹션으로 구성됩니다. 2개의 추가 단면도는 선택사항이고 형광 세포의 항원 추출 정량화 및 화상 진찰에 전념합니다.
여기서 설명된 TFM 방법은 B 세포의 활성 기계적 능력에 대한 체계적인 연구를 가능하게 한다. B 세포의 맥락에서, 이것은 항원 추출 및 내산화 능력과 관련이 있다. 다른 TFM 방법에 비해, 여기에 제시된 프로토콜은 간단하고 오히려 재현할 수 있습니다: 유리 마이크로스피어의 들여쓰기및 Hertz 모델을 사용하여 측정된 강성은 400~600 Pa. 유사한 프로토콜이 B세포(35)뿐만 아니라 T세포(36)에도성공적으로 사용되었다. 나노필라오스(T림프구(37)에비해 평평한 균일한 표면을 제공하므로 겔의 상호작용이 주로 표면에 접선으로 제한됨에 따라 해석이 용이하다.
우리가 설명한 프로토콜은 항원 제시 기판에 B 세포에 의해 가해지는 힘의 현면역학에 접근을 제공합니다. 공간 수준에서 이것은 힘의 국소화에 대한 정보를 제공하고, 형광 현미경 검사법과 함께, 실험자가 특정 분자의 존재와 지역 세력의 상관 관계를 가능하게한다 (즉, 세포 골격 또는 BCR 신호 캐스케이드의 구성 요소). 시간 적 수준에서, 수량(예: 총 에너지 또는 총 응력)을 통합하여 시간당 하나의 값을 제공하고 소음을 줄일 수 있습니다. 이를 통해 제시간에 견인력의 진화(성장 및 고원)와 맥동 패턴의 존재를 관찰할 수 있습니다.
분석에 대한 중요한 실험 적 측면은 다음과 같이 설명됩니다. (i) 세포 밀도: 올바른 분석을 수행하려면 세포가 충분히 분리되어야 합니다. 셀이 주변에 자체 크기의 빈 영역이 있는 경우 셀을 분석할 수 있다고 고려합니다. (ii) 전송 영상: 실험 중에 세포의 적어도 전송 영상을 수집하여 분석에서 마스크로 사용하는 것이 좋습니다. (iii) 이미지의 구슬 수: 시냅스의 구슬 수가 30에서 200(즉, 1-8 구슬/μm²) 사이인 이미지만 분석하는 것이 좋습니다. 밀도가 낮을 때 적절한 맵 변위 재구성이 허용되지 않습니다. 비드 밀도가 높음으로 단일 파티클 추적이 불안정해집니다. (iv) 실험 중에 구슬 의 수는 일정해야 한다; 그러나, 변동은 화상 진찰 조건 (특히 서로 너무 가까운 구슬에서) 화상 진찰 조건에서 작은 가변성 때문에 생길 수 있습니다. 포커스 드리프트가 발생하면 수정해야 하며 문제가 있는 프레임을 폐기해야 합니다. (v) 젤 품질: 너무 많은 균열을 가진 젤, 구슬 분포또는 너무 두꺼운 젤의 가변성은 버려야 합니다. (vi) 세포 유형에 따라, 반복 된 노출 후, 늦은 시간 지점에서 세포 (>300 프레임) 광독성 효과를 겪을 수 있습니다. 데이터와 비교할 “기준선”으로 세포가 없는 마스크에서 프로그램을 실행하는 것이 좋습니다. 이것은 실험 조건으로 인한 노이즈 레벨의 크기를 제공합니다.
고전적인 접착력에서 견인력을 측정하는 데 사용되는 젤은 초점 접착(액틴 흐름 및 신호 분자 모집)에서 발생하는 공정의 조사를 가능하게 합니다(힘이38,39로적용되는 지점). 그러나 시냅스의 힘은 초점 접착을 통해 적용되지 않습니다. B 세포 면역 시냅스에서의 힘 발생의 현면 패턴은 최근까지 이 방법을 사용하여 정량적으로 조사되지 않았다. TFM을 사용하여, 우리는 우리의 최근 연구6에서제시된 바와 같이, B 세포 면역 시냅스에서 힘 패터닝을 처음으로 관찰, 림프구의 연구에 격려 관점을 열어.
특히, 이 방법은 겔상에 셀이 도착하기 전에 촬영한 이미지를 힘 계산에 대한 기준 이미지로 채용한다. 일반적인 TFM 프로토콜은 트립신으로 세포를 분리 한 후 실험의 끝에 참조 이미지를 취하는 것이 좋습니다. 이를 통해 실험자는 세포가 풍부한 영역을 찾을 수 있습니다. 이것은 여기에서도 가능하지만 트립신은 항원 코팅 젤에서 B 세포를 분리하는 데 다소 비효율적이며, 분리를 위해 오래 기다려야하며 겔 변형 및 움직임의 위험 (전체 데이터를 악용 할 수 없게 함)이 더 높습니다.
여기에 제시된 방법은 유연하고 다른 단백질을 젤 표면에 접목할 수 있으므로 면역 시냅스에서 다른 신호의 효과를 연구하도록 적용할 수 있습니다(예를 들어, 인테그린 리간드 및 면역글로불린이 테스트되었습니다)과 형광 항원(섹션 4 참조). 더욱이, 세포는 약물 치료 및 국부적 혼란을 위한 실험자가 접근할 수 있습니다. 마지막으로, 이 방법은 이미징 고정 셀과도 호환됩니다. 이러한 관찰을 위해, 커버 슬립에 젤을 만드는 것이 좋습니다, 세포를 얼룩, 슬라이드에 커버 슬립을 접착제 와 마운팅 미디어와 다른 커버 슬립을 추가. 관찰은 젤을 통해 이미지의 저하를 피하기 위해 상단에 젤로 수행됩니다.
가능한 함정은 중합 및 코팅내젤의 가변성이다. 중합 문제는 주로 이시화기/촉매의 품질 에 기인한다. 또한, 겔은 특히 조립 직후 사용하지 않을 경우 팽창할 수 있습니다. 이 문제는 겔의 기계적 특성에 극적으로 영향을 미치지 않는 것처럼 보이지만 비드 층을 목표에 도달할 수 없게 하여 젤을 효과적으로 쓸모없게 만들 수 있습니다. 이 문제가 나타날 때 각 조건에 대해 추가 젤을 준비하는 것이 좋습니다. 코팅에는 일정한 가변성이 있을 수 있으며, 신선하게 희석된 Sulfo SANPAH를 갖는 것이 중요합니다.
결론적으로, 우리는 BCR 리간드에 의해 활성화될 때 면역학적 시냅스에서 B 세포에 의해 가해지는 힘을 측정하는 간단하고 저렴하며 재현 가능한 방법을 설명했습니다. 적절한 수용체 리간드를 사용하여 다른 리간드 및 다른 종류의 림프구(메모리 B 세포, T 세포 등)에 대한 반응을 연구하도록 조정할 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 중요한 독서에 대한 M. 볼거 – 먼로감사와 이미지 수집 및 퀴리 동물 시설에 대한 지원을 위해, 프랑스 – 바이오 이미징 국가 연구 인프라의 회원, 파리, Institut Curie, 파리, 니콘 이미징 Center@CNRS – 인스티투트 큐리와 PICT-IBiSA를 인정합니다. PP는 CNRS에 의해 지원되었다. AK와 JP는 파리 데카르트 박사 펠로우십과 에콜 닥터탈 파이어-프로그램 베텐쿠르의 지원을 받았습니다. 이 프로젝트는 PP (ANR-10-JCJC-1504-Immuphy)와 AMLD (ANR-PoLyBex-12-BSV3-0014-001, ERC-Strapacemi-GA 243103)에 대한 보조금으로 지원되었습니다.
3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | Store aliquoted, protected from humidity |
40% Acrylamide Solution | Biorad | 1610140 | |
Alexa555 microscale protein labeling kit | Molecular Probes | A30007 | |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
B cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-862 | |
B-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
2% Bis Solution | Biorad | 161-0142 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Euromedex | 04-100-812-C | |
Coverslip 18mm | VWR | 631-1580 | |
Fetal calf serum | PAA | A15-151 | Decomplemented (40min @56°C) |
Fluorodishes FD35 | World Precision Instruments, Inc | FD35100 | |
Fluosphere: carboxylate-modified, 0.2um, dark red | Molecular Probes | F8807 | |
Hen Egg Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Stocked in aliquote 100mg/ml |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermofisher/Gibco | 11140035 | |
N,N,N',N'-tetrametiletilendiammine (TEMED) | Euromedex | 50406-B | |
PBS (Phosfate Buffer Saline) | Gibco | 10010-015 | |
Penicillin–streptomycin | Gibco | 15140-010 | |
RMPI 1640 – Glutamax I | Thermofisher | 61870-010 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 |