Traction Force Mikroskopi till studie B lymfocyt Aktivering

Summary

Här presenterar vi ett protokoll som används för att utföra traction force mikroskopi experiment på B-celler. Vi beskriver beredningen av mjuka polyakrylamid geler och deras funktionalisering, samt data förvärv i mikroskopet och en sammanfattning av data analys.

Abstract

Traction force microscopy (TFM) möjliggör mätning av krafter som produceras av en cell på ett substrat. Denna teknik härda slutsatsen dragkraft mätningar från ett experimentellt observerade förskjutning fält som produceras av en cell drar på ett elastiskt substrat. Här anpassade vi TFM för att undersöka den rumsliga och tidsmässiga strukturen hos kraftfältet som utövas av B-celler när de aktiveras av antigen engagemang av B-cellens receptorn. Gelstelitet, pärldensitet och proteinfunktionalisering måste optimeras för studier av relativt små celler (~ 6 μm) som interagerar med, och svarar specifikt på ligander för cellytreceptorer.

Introduction

B-celler är de antikroppsproducerande cellerna i immunsystemet. För att aktivera det adaptiva immunsvaret förvärvar de först antigenet i en infödd form (dvs icke-bearbetad) genom en specifik receptor som kallas B-cellreceptor (BCR)¹. Denna process sker i lymfkörtknuten B cellzonen. Även om vissa antigener kan nå B-cellen genom lymfvätskor, de flesta antigener, särskilt med hög molekylvikt (>70 kDa, som är gränsen storlek för lymfatiska ledningar) verkligen presenteras i sin inhemska form på ytan av en antigen presentera cell (APC), typiskt en subcapsular sinus makrofag eller follikulär dendritisk cell, genom lectin eller Fc receptorer (icke-specifika). Kontakten med denna cell leder till bildandet av en immunsynaps där BCR utövar kraft på de APC-associerade antigenerna. Bindningen av ett antigen till BCR initierar BCR-signalering, som kan aktivera kraftalstrande mekanismer. Dessa krafter kan vara viktiga för att förstärka BCR-signalering, men är också nödvändiga för B-celler att extrahera och sedan internalisera antigenet.

Nyligen genomförda studier har visat att BCR verkligen är mekanosenstiv². Till exempel styvare substrat framkallar förstärkt BCR signalering³. Dessutom, kraft som genereras vid immun synapsen drar på enda BCRs att sond dess affinitet till antigen och därigenom säkerställa affinitet diskriminering⁴. Det är därför intressant att undersöka den mekaniska responsen av B-celler till antigen presentation och att dissekera detta svar i termer av typ av inblandade receptorer (IgG/ IgM)⁵, adhesion molekyler (integrin ligander) eller i farmakologiskt och genetiskt modifierade celler (dvs. tysta ett protein nedströms BCR signalering eller cytolesketon dynamik)⁶.

En enkel metod för att observera en cells respons på ett substrat av fysiologisk stelhet och samtidigt studiekrafter som utövas på substratet är Traction Force Microscopy (TFM). TFM består av att observera det förskjutningsfält som produceras av cellen dra på ett elastiskt substrat. Ursprungligen deformation av gelen observerades genom rynkor av elastomeren själv genom fas-kontrast mikroskopi⁷, men införandet av fluorescens microbeads som fiducial markörer tillåtet för bättre upplösning och har sedan dess blivit standard⁸. Denna metod har använts för att undersöka den dragkraft som utövas av anhängare celler, vävnader, och även organoider inbäddade i geler. Flera varianter av TFM har utvecklats⁹ inklusive, kombination med superresolution mikroskopi (dvs, STED¹⁰ eller SRRF¹¹), modifiering av brytningsindex för gelen för att möjliggöra TIRF mikroskopi¹², ersätter pärlor med nano-tryckta mönster¹³, och med hjälp av nanopillars i stället för plan yta¹⁴. För en fullständig genomgång av dessa variationer, se Colin-York et al.¹⁵.

Protokollet presenteras här beskriver ett förfarande för att mäta krafter som utövas av B-celler på en antigen-belagda substrat. Dessa krafter appliceras på liganderna (antigen) för att klustra dem och därefter utvinna dem ur det antigenpresentativa substratet. Vi har anpassat standard-TFM-protokollet för att efterlikna styvheten hos fysiologiska antigenpresentande substrat, storleken och den relevanta beläggningen för B-cellerna. Detta protokoll möjliggör studier av flera celler samtidigt och kan användas tillsammans med fluorescensmikroskopi tekniker och kemiska behandlingar. Det syftar dock inte till att sond enda molekyl kraft mätningar, för vilka optisk pincett¹⁶, molekylär spänning sonder^17,18, biomembran kraft sonder¹⁹, och atomkraft mikroskopi²⁰ är mer lämpliga tekniker. Jämfört med andra encelliga kraftmätningsmetoder (t.ex., mikropipettes²¹ eller mikroplattor²²) tillåter TFM för rekonstruktion av en komplett karta över de krafter som utövas vid synapsen med en upplösning på ~300 nm. Detta är användbart för att identifiera spatio-temporala mönster i de krafter som utövas på ytan och, som gelen är kompatibel med confocal avbildning, att korrelera dem med rekrytering av specifika proteiner (till exempel cytoskelett och signalering proteiner).

Även om 3D TFM är möjligt, är det inte förenligt med styvhet och setup vi använde. Deformationer i 3D kan uppnås genom andra mer komplexa uppställningar såsom utsprång kraft mikroskopi (AFM skanning en deformerbar membran där cellerna är pläterade)²³,^{24 och}elastisk resonator störningar stress mikroskopi (ERISM, en gel som fungerar som resonans hålighet för ljus och belysa deformationer av substratet med noggrannhet på några nanometer)²⁵. Även om dessa tekniker är mycket lovande, har de ännu inte varit anställda i B-celler. Andra typer av TFM, såsom på nanopillars¹⁴, skulle kunna användas för att ha mer reproducerbara substrat. Denna geometri är dock inte anpassad till mjuka celler då cellen interpenetrates pelarna, vilket komplicerar analysen. Detta tillvägagångssätt har verkligen använts i T-celler för att observera cellens förmåga att bygga strukturer runt pelarna²⁶.

Trots sin enkelhet, TFM med hjälp av polyakrylamid geler möjliggör samtidig observation av många celler och kan enkelt och billigt genomföras i alla lab utrustad med en bänk och en epifluorescens mikroskop (även om vi rekommenderar confocal/spinning disk).

För att efterlikna den fysiologiska styvheten hos en APC använde vi polyakrylamidgeler med en styvhet på ~500 Pa²⁷ och funktionaliserade gelen med aktiverande antigener. I detta protokoll, vi funktionaliserade ytan av polyacrylamide gel med hen ägg lysozym (HEL). Detta möjliggör mätning av krafter som genereras genom stimulering av BCR genom engagemang av antigenbindningsstället. Användningen av detta antigen och de HEL-specifika B-cellerna från MD4-möss säkerställer relativt enhetlig kraftgenerering som svar på antigenligering²⁸. Andra molekyler (såsom anti-IgM för B6-möss) kan dock ympas på gelen, men de krafter som genereras i dessa fall kan vara mer heterogena och mindre intensiva. Eftersom B-celler är små celler (diameter ~6 μm) har antalet pärlor optimerats för att vara maximalt men ändå spårbart. För stora celler som utövar ~kPa-krafter på sina substrat kan man uppnå tillfredsställande resultat med hjälp av relativt glesa pärlor eller utföra enkla partikelbildshastigheter (PIV) för att rekonstruera deformationsfältet. Men för små celler som B-lymfocyter som utövar stress så liten som ~ 50 Pa, är användningen av en partikel spårning krävs (partikel spårning velocimetry, PTV) för att uppnå önskad noggrannhet vid rekonstruera deformation fältet. För att på ett tillförlitligt sätt spåra pärlor individuellt, förstoringen av objektivet linsen måste vara minst 60x och dess numeriska bländare runt 1,3. Således måste gelerna vara relativt tunna (<50 μm), annars är pärlorna inte synliga eftersom de är över målets arbetsavstånd.

Huvudprotokollet består av tre sektioner: gelberedning, gelfunktionalisering och bildframställning; två avsnitt till är frivilliga och är dedikerade till antigenutvinningskvantering och avbildning av fluorescerande celler.

Protocol

1. Gelpreparat Silanisering av gelstödet Aktivera täckslip eller glas-botten Petriskål (som kommer att användas som gel stöd) med en UV-lampa i 2 min (vänta 30 s före exponering för UV-lampan för att undvika exponering för kvarvarande ozon). Silanize den coverslip/ glas-botten skålen med hjälp av 200 μL aminopropyltrimeoxisilan (APTMS) i 5 min. Detta kommer att förbereda stödet för den kovalenta bindningen av gelen. Tvätta noggrant täckplattan/glas-bottenfatet med ultrarent vatten. Torka täcket/glas-botten skålen med hjälp av vakuum strävan. Beredning av 18mm coverslip som används för att platta gelen För att förbereda täcken, först sätta dem i en keramisk täckpapper hållare. Lägg sedan täckpappershållaren i en liten bägare (50 mL) och häll silikoniseringsreagens (lagrad vid 4 °C, återanvändbar) över täcksläppen, var noga med att helt täcka över dem. Täck bägaren med aluminiumfolie och inkubera i 3 min i rumstemperatur. Under väntan fyller du en stor bägare (500 mL) med ultrarent vatten. Efter 3 min inkubation i silikoniserande reagens, överför du täckskyddshållaren med täckslips till bägaren med vatten. Skölj noga täcken med ultrarent vatten, torka dem väl och håll på pappersservetter. För bästa resultat, fortsätt omedelbart till nästa avsnitt. Gel polymerisation För geler på 0,5 kPa, blanda 75 μL av 40% akrylamid med 30 μL av 2% bisakrylamid (crosslinker) och 895 μL av fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Denna premix kan lagras i upp till en månad vid 4 °C. Till 167 μL av 0,5 kPa gel premix, tillsätt 1% (1,67 μL) pärlor, virvel och soniker i 5 min i ett bad sonicator (standard bänk ultraljud renare med effekt på 50–100 W och frekvens 40 kHz). Håll blandningen skyddad från ljus med hjälp av aluminiumfolie.OBS: Premixen polymeriserar inte förrän initieraren (TEMED) läggs till. För att katalysera polymerisering, tillsätt 1% (1,67 μL) av 10% w/v ammoniumpersulfat (APS). För att initiera polymerisering, tillsätt 0,1% (0,2 μL) N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED). Blanda med en pipett. När APS och TEMED har lagts till, polymeriserar gelen snabbt så fortsätt snabbt till gelgjutning. Gel gjutning Pipet 9 μL av gel blanda på varje täcken / glas-botten skålen (droppe i centrum, Figur 1A) Placera silaniserad/hydrofoba täckplattan och platta till gelen (Bild 1B). Med hjälp av forceps trycker du på täcket för att säkerställa att gelen sprider sig över hela området av täcket (Figur 1C) tills det börjar läcka ut. Invertera täcket/glas-botten skålen i en stor Petri skålen och knacka den på bänken för att tvinga pärlor går mot gel ytan (Figur 1D). Täck med aluminiumfolie och låt stå i 1 h för att polymerisera vid rumstemperatur i en fuktig kammare (dvs. sätta en våt vävnad ovanför skålen för att förhindra avdunstning). Efter 1 h, lägg TILL PBS till provet för att underlätta coverslip release. Försiktigt, ta bort täckskydd med hjälp av en nål (beläggningen med olika silaner bör tillåta enkel avskalning av täckslip från gelen, Figur 1E). Låt gelen vara kvar i PBS.OBS: Geler kan nu förvaras i PBS vid 4 °C i 5–7 dagar, men det rekommenderas att använda dem inom 48 h. 2. Gel funktionalisering Förbered sulfosuccinimidyl 6-(4′-azido-2′-nitrofenylamino)hexanoat (Sulfo SANPAH) lösning vid 0,5 mg/mL i 10 mM HEPES buffert. Denna kan förvaras vid 4 °C täckt med aluminiumfolie i upp till en vecka. Aspirera PBSEN från gels. Tillsätt 150 μL sulfo SANPAH till gelen vid rumstemperatur (Bild 1F). Exponera gelen för UV-behandling i 2 min för att fotoaktivera platserna för Sulfo SANPAH och få den att fastna på gelytan. Tvätta med PBS tre gånger (Bild 1G). Upprepa steg 2.2–2.5. Tillsätt 250 μL hel (100 μg/mL) till varje gel och inkubera över natten i en fuktig kammare vid 4 °C över natten samtidigt som den håller täckt med aluminiumfolie (Figur 1H). Ta bort HEL-antigen och tvätta med PBS tre gånger.OBS: HEL fungerar både som ett antigen och som en vidhäftningsmolekyl. Den kan ersättas med andra molekyler som binder till receptorn (t.ex., en anti-mus IgM, Bovint SerumAlbumin, Ovalbumin) eller blandas med integrin ligander (t.ex. ICAM1 bindning till LFA1). Vid behov kan antigenutsug observeras med en fluorescerande version av HEL (erhålls genom färgning av molekylen med en proteinmärkningssats, se steg 4). Observera att en viss koncentration i bulk kanske inte ger samma ytkoncentration på gelen som på glaset: detta måste kvantifieras med sekundär färgning om direkt jämförelse krävs. 3. Cell lastning och bildframställning Innan bildtagning, ta bort PBS från gelerna och tillsätt 500 μL av B-cellmedia (RPMI 1640, 10% decomplemented fetala kalv serum, 1% penicillin-streptomycin, 2% Natrium Pyruvat, 50uM Merkaptoetanol och 1X Icke essentiella aminosyror) och låt dem jämvikt till RT. Förberedelse av celler Rena primära B-celler från mjälte enligt ett negativt urvalsprotokoll (se Table of Materials). Typisk slutcellsutbyte är runt 1 x 107 celler. Koncentrera detta till 3 x 106 celler/mL i B-cellmedium (RPMI-1640 kompletterat med 10% fetalt kalvserum, 1% penicillin–streptomycin, 0,1% merkaptoetanol och 2% natriumpyuvat). Förvara celler efter behov i upp till 6 h vid 4 °C. Håll cellerna på 37 °C i 30 min före bildförvärv. Imaging Använd ett konfokalmikroskop med termisk och (eventuellt) CO2-kontroll.OBS: Oavsett om ett konfokal- eller spinn-diskmikroskop används är det viktigt att använda ett objektivt/hål som gör att en pixelstorlek <200 nm bekvämt spårar pärlorna i analysfasen (t.ex. 60x, NA 1.3). Epifluorescens mikroskopi kan också användas, men det ger lägre signal till brus förhållande och kan göra enskilda pärla spårning svårare. Två huvudlager av pärlor kommer att visas på botten och toppen av gelen. Fokusera på gelplanet.OBS: En fin gel kommer att visas som en stjärnhimmel, med pärlor ungefär jämnt fördelade på samma plan. Programmera förvärvet för 30 min med en bildhastighet på 5 s (detta är anpassningsbart till behoven i experimentet, t.ex. Aspirera media från gelen, lämnar ca 200 μL media på gelen. Placera gelen på mikroskopet och hitta ytskiktet av pärlor och ett trevligt jämnt område på gelen. Tillsätt 80 μL celler (undvik att vidröra gelen för att behålla fokus). Se till att fokus fortfarande är korrekt och att celler kan ses fallande i området (under transmitterat ljus). Starta förvärvet innan cellerna når gelen. Vid oavsiktlig kontakt med gel, vibrationer eller fokusavdrift, justera fokus.OBS: Det är avgörande att samla in en bild av den avslappnade gelen och detta kan vara någon bild tagen före ankomsten av cellerna på gelen. 4. Fluorescerande HEL extraktion experiment Förbered fluorescerande HEL genom att binda ett fluorescerande färgämne (av en färg som skiljer sig från pärlorna en som Alexa 555), se Tabellen för material. I steg 2.7, byt konventionell HEL med den fluorescerande HEL. Skaffa bilder med låga belysningsinställningar eller låg bildhastighet (t.ex. 2 bilder per minut) för att undvika fotoblekning. För att kvantifiera HEL extraktion, beräkna intensiteten integreras över cellområdet för varje ram I(t) korrigeras och normaliseras av intensiteten I(0) av ram 0 enligt formeln:OBS: Antigenet konjugerat med fluorofore syns inte (troligen på grund av släckning av fluorofore vid gelytan), men dess närvaro på gelén kan verifieras med en anti-HEL och en fluorescerande sekundär antikropp. Det kan verifieras att fluoroforen verkligen är fluorescerande när den lossnar genom att ta bort den från gelén med en täcks med anti-HEL och avslöja den med en sekundär fluorescerande antikropp (på täcket)6. Signalen av det extraherade antigenet är mycket svagt och maskeras ibland av läckage av pärlorna. Om man endast är intresserad av antigenutdragning rekommenderas att gelen utan pärlor förbereds (hoppa över steg 1.3.2 och 1.4.3). 5. Avbildning av fluorescens Erhåll fluorescerande B-celler genom att rena B-cell från mjältarna hos genetiskt modifierade möss som gjort för vildtypen (t.ex., från Lifeact-GFP- eller Myosin II GFP-möss). För bildgivande lysrörsceller, använd (om möjligt) ett snurrande diskmikroskop med ett vattenbadslångt 40x–100x-mål. Håll exponeringens varaktighet och bildhastighet låg för att undvika blekning.OBS: Punktspridningsfunktionen i Z är starkt nedbrytad av närvaron av gelén, därav föreslår vi att man använder ett vattenbadmål. Levande upprätt mikroskopi med vattendoppningsmålen lider av starka sfäriska aberrationer som framkallas av närvaron av (sfärisk) cellen (och cellkärnan) i emissionsbanan. 6. Analys OBS: Dataanalys är i allmänhet utförs genom att först korrigera hela stacken för drift, hitta pärlorna i varje ram, spåra deras rörelser med avseende på en referensram (tas i frånvaro av celler), interpolera förskjutningsfältet och invertera problemet för att få stressen med hjälp av Fourier transform29. För detta ändamål föreslår vi att du använder en kombination av ImageJ Macro och MATLAB program nedladdningsbara från en online-lagringsplats30. Öppna filmen i ImageJ som hög med bilder Kör makrot “Crop_and_save.ijm” Välj de områden av intresse (ROI) med “Rectangle” verktyget och lägg till dem i ROI-listan med hjälp av ‘t’-tangenten. När du beskär cellen, se till att inkludera en region på minst 5– 10 pixlar med orörliga pärlor. Uteslut celler som ligger för nära gränserna eller till andra celler från analysen. När färdig klicka på ‘OK’. Makrot föreslår en mask av cellen: om detta är tillfredsställande klicka på “OK”. Om inte tillfredsställande, klicka på “Inte ok” och välj sedan manuellt en sluten region med något urvalsverktyg (t.ex. “Freehand” eller “Oval”) och klicka på “Fortsätt”. Öppna MATLAB och kör “TFM_v1.m”. Mata in de parametrar som krävs: kontrollera särskilt bildegenskaperna (pixelstorlek, tidsintervall för förvärv) och gelegenskaperna (Young modulus E, Poisson ratio). Referensbilden är inställd på att vara den första som standard. Ställ in den på en annan ram om det behövs eller ställ in den på “0” för att läsa in en extern fil. Leta reda på utgångarna av programvaran i samma katalog som originalfilen (för en beskrivning se den User_notice.pdf filen). Detta inkluderar en preliminär spår av pärlorna (“FILENAME.fig”), en tomt av den kontraktila energi över tiden (“FILENAME_energy.fig”), en tabell över flera kvantiteter integrerade över cellen (energi, område, stunder, etc) “FILENAME_finaltable.mat”, en struktur som innehåller deplacement och kraftfält, filmer av pärlan, förskjutningsfält, stress och energi (som kan öppnas med någon avi läsare).OBS: I indataparametrarna är “Fönsterstorleken” fönstret över vilket förskjutningen interpoleras, därav den slutliga upplösningen av fältet stress och förskjutning. Detta är inställt på några (som standard fyra) pixlar. Det är inte tillrådligt att minska detta eftersom det skulle på konstgjord väg öka upplösningen genom att interpolera regioner där det inte finns några pärlor.

Representative Results

Med tanke på storleken på cellerna, algoritmer som extraherar förskjutningskartan av pärlorna via korrelativa tekniker (såsom partikelbildshastighet) är i allmänhet inte särskilt exakt. Men beroende på graden av upplösning som krävs, kan man enkelt få kvalitativa resultat med hjälp av en fri Fiji / ImageJ plugin31,32. Medan detta tillvägagångssätt är tillräckligt för att jämföra stimulerande kontra icke-stimulerande förhållanden, för en grundlig analys rekommenderar vi att du använder vår programvara nedladdningsbar från en online-lagringsplats30, som spårar pärlorna individuellt och ger förskjutningsfältskartan vid en viss tidpunkt som interpolationen av de enskilda pärla förskjutningar33. Flera kvantifieringar är möjliga i detta läget. Till exempel (genom att anta förskjutningen orsakas endast av stress tangentiell till gelen yta) programvaran ger också stressen vid varje punkt orsakar att specifika förskjutning karta. Detta är en typ av “inversion problem”: förskjutningen vid en viss punkt beror på summan av alla krafter som tillämpas över de andra punkterna. “Inversionsalgoritmen” tar hänsyn till substratets fysiska parametrar: dess styvhet (Young modulus) och Poisson-förhållande. Direkta algoritmer är vanligtvis mycket exakta men beräkningsmässigt dyra. Algoritmer baserade på Fourier transform, liksom vår, utföra i huvudsak en deconvolution i Fourier rymden och är mer effektiva men benägna att vissa fel (främst på grund av interpolation steg). Dessa algoritmer kräver allmänt att trimma av en parameter som förhindrar lilla lokal (och potentiellt artifactual) förskjutningar för att bli för relevant i uträkningen av stressen sätter in (Tikhonov regularizationparameter8,29; “Regularization” variabel i dialogfönstret; här vi typiskt ställa lika med 5 x 10-19). För mer avancerad tolkning och analys, såsom spatio-temporala korrelationer, lokala rörelser, korrelationer med fluorescerande kanaler, rekommenderar vi att samarbeta med experter inom området. För en översyn av beräkningsmetoder se Schwarz et al.9. Som nämnts ovan, korrekt pärla bilder ser ut som en “stjärnhimmel”, en enhetlig och slumpmässig fördelning av ljusa fläckar (Figur 2A). Data och analys är inte tillförlitliga när antalet pärlor är för lågt (Bild 2B) eller bilden är ur fokus (Bild 2C). När B-celler har bosatt sig på ytan av gelen, pärlorna under cellerna börjar röra sig på grund av dragkraft utövas av cellen på gelen. Ramar som pärlorna inte är spårbara för ska kasseras. Som kontroll är det möjligt att genom öga observera förflyttning av pärlor som jämför “referensramen”, typiskt den som föregår cellens första kontakt med substratet. Ungefärliga resultat kan erhållas från den enda partikelspårningen (t.ex., Trackmate, Fiji 34) som gjort i figur 3A. Analysen ger en segmentering av pärlorna i referensbilden (“FILENAME.fig”) som en kontroll. Med den programvara vi föreslår kan man få förskjutningen (Figur 3B) och stressfältet (den lokala stressens vektor vid varje pixel och varje tidspunkt som erhålls genom inversion från förskjutningsfältet, Figur 3C). Skalär produkt av de förskjutning och kraftfält integrerade på cellens areal ger totalt arbete som utövas av cellen på underlaget (Figur 4A). Denna beräkning kräver masken av cellen som infördes i steg 6.2 av protokollet. För att jämföra två biologiska förhållanden (som aktiverande HEL kontra icke-aktiverande substrat BSA, eller vild typ kontra knock-out) är det praktiskt att beräkna den genomsnittliga kurvan (Figur 4B) eller, ännu mer syntetiskt, ett genomsnittsvärde under de senaste tidspunkterna (20 min) där energin når en platå (Figur 4C). När den rumsliga informationen av styrkorna är relevant är det möjligheten som jämför singeltidpunkter av varje villkorar (bild 4D). Hänvisa till Kumari et al.6 för djupare analys. Ett exempel på fluorescensantigenutdragningstidsfördröjning visas i figur 5A: det progressiva utseendet av fluorescenssignaler vid synapsen indikerade antigenavlossning från gelen. Den genomsnittliga extraktionskurvan med sitt konfidensintervall (standardfel för medelvärdet) över 15 celler visas i figur 5B. Bild 1: Schematisk visning av beredningen av gelén och dess funktionalisering. Steg beskrivs i protokollet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur. Figur 2: Tre exempel på pärlbilder av olika kvaliteter. ( A )Exempelpå pärlbild med rätt signal-till brusförhållande och rätt densitet. (B) Exempel på bilder med ett för otillräckligt antal pärlor och (C) ur fokus plan. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur. Bild 3: Bearbetning av bilderna för att extrahera kraftfältet. (A) Exempel på en bild av pärlorna (kontur av cellen i vitt, extraherad från transmissionsbilden), pärlspårning vid tiden t = 5 min (röd övertäckning) och förskjutning (pilar) i förhållande till tiden t = 0 min (skala bar 5 μm). (B) Interpolerade förskjutningsfält (representerat som vektor koger och magnitud karta, pilar är proportionella mot förskjutningen [nm]; se färgfältet till höger); botten: en jämnare bild av magnituden (erhållen genom interpolation med bikubisk funktion). (C) Stressfält från förskjutningsfält i panel B (representerat som vektorkyr och magnitudkarta; pilarna är proportionella mot skjuvningsstressen [Pa]; se färgfältet till höger); botten: en jämnare bild av magnituden (erhållen genom interpolation med bikubisk funktion). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur. Figur 4: Exempel på information som kan extraheras från kraft- och förskjutningsfält. (A) Exempel på utveckling av energi i tid för en enda cell: en platåfas (markerad i grått) dyker upp efter ca 10 min. (B) Jämförelse av de genomsnittliga energikurvorna och (C) av de relativa platånivåerna för 65 celler pläterade på HEL (aktiverande) belagda gel och 35 celler på BSA (icke-aktiverande) belagda gel (medianen för ± interquartila intervall visas, Mann- Whitney-test användes för statistisk signifikans). (D) Time-lapse färgkartor av stress för HEL och kontroll BSA skick; både magnitud och koger tomter visas. Dessa bilder har anpassats från Kumari et al.6. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur. Figur 5: Exempel på experiment med fluorescerande antigen. (A) Tidsförlopp för extraktion av fluorescerande HEL (nedan: procent av den maximala, skalstång = 3μm). (B) Antigen insamling över tiden (Mean ± SEM, n = 15). Dessa bilder har anpassats från Kumari et al.6. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Discussion

DEN TFM-metod som beskrivs här möjliggör en systematisk studie av B-cellernas aktiva mekaniska förmåga. I samband med B-celler är detta relaterat till förmågan att extrahera och internalisera antigenet. Jämfört med andra TFM-metoder, det protokoll som presenteras här är enkel och ganska reproducerbara: styvheten, mätt genom indrag av ett glas mikrosfär och med hjälp av Hertz modell, är mellan 400 och 600 Pa. Liknande protokoll har framgångsrikt använts inte bara för B-celler³⁵ men också för T-celler³⁶. I jämförelse med nanopillars (används även för T-lymfocyter³⁷) det ger en plan homogen yta, därav resultaten är lättare att tolka som samspelet av gelen är främst begränsad för att vara tangentiell till ytan.

Det protokoll vi beskrev ger tillgång till spatiotemporal dynamiken i de krafter som utövas av B-celler på antigen-presentera substrat. På den rumsliga nivån ger detta information om lokalisering av krafter, och i kombination med fluorescensmikroskopi, gör det möjligt för försöksmaskinen att korrelera lokala krafter med förekomsten av specifika molekyler (dvs. komponenter i cytoskeleton eller BCR-signaleringskaskad). På tidsnivå är det möjligt att integrera mängder (såsom total energi eller total stress) för att ge ett värde per tidpunkt och minska bullret. Detta möjliggör observation av utvecklingen av dragkraften i tid (tillväxt och platå) och förekomsten av pulsatila mönster.

Kritiska experimentella aspekter för analysen beskrivs som följande. i) Celltäthet: för att utföra en korrekt analys bör celler vara tillräckligt åtskilda. Vi anser att en cell kan analyseras om den har en tom region av egen storlek runt den. ii) Transmissionsbild: det är lämpligt att samla in åtminstone en transmissionsbild av cellerna under det experiment som ska användas som mask i analysen. (iii) Antal pärlor i bilden: vi föreslår att analysera endast bilder där antalet pärlor i synapsen är mellan 30 och 200 (dvs. 1–8 pärlor/μm²). Lägre tätheter tillåter inte för adekvat karta förskjutning återuppbyggnad. Höga pärltätheter gör en partikelspårning opålitlig. iv) Antal pärlor bör vara konstant under försöket; fluktuationer kan dock uppstå på grund av små variationer i bildförhållandena (särskilt hos pärlor som ligger för nära varandra). Fokusavdrift, om inträffar, måste korrigeras och problematiska ramar bör kasseras. (v) Gelkvalitet: geler med för många sprickor, variabilitet i pärlorsfördelning eller geler som är för tjocka ska kasseras. vi Beroende på celltyp kan celler vid sena tidpunkter (>300 bildrutor) efter upprepade exponeringar drabbas av fototoxiska effekter. Det är lämpligt att köra programmet på en mask saknar celler som en “baslinje” som skall jämföras med data. Detta ger en magnitud av bullernivån enbart på grund av de experimentella förhållandena.

Geler som används för att mäta dragkraft i klassisk vidhäftning möjliggör för undersökning av processer som sker vid fokal adhesion (aktinflöden och rekrytering av signalmolekyler)—de punkter där krafter appliceras^38,39. Dock är krafter vid synapsen inte tillämpas genom fokala sammanväxningar. Den spatiotemporal mönster av kraft generation vid B-cellen immun synaps har inte undersökts kvantitativt med denna metod tills nyligen. Använda TFM, observerade vi för första gången, kraft mönstrar vid B-cellen immun synaps, som presenteras i vår senaste studie⁶, öppna uppmuntrande perspektiv i studien av lymfocyter.

Noterbart är att denna metod använder en bild som tagits före ankomsten av cellerna på gelen som en referensbild för kraftuträkningen. Vanliga TFM-protokoll föreslår att referensbilden tas i slutet av experimentet, efter att ha löst cellerna med trypsin; detta gör att experimenter att leta efter en region rik på celler. Även om detta är möjligt även här, trypsin är ganska ineffektivt på att lossa B-celler från antigen-belagda gel, måste man vänta länge för lossnar och risken för gel modifiering och rörelser (som gör hela datamängden oexploiterbar) är högre.

Den metod som presenteras här är flexibel och kan tillämpas för att studera effekten av andra signaler vid immunsynapsen eftersom den möjliggör ympning av andra proteiner på gelytan (t.ex. integrin ligander och immunglobuliner har testats) och även fluorescerande antigen (se avsnitt 4). Dessutom är cellerna fortfarande tillgängliga för försöksflamenten för läkemedelsbehandling och lokala perturbations. Slutligen är metoden också kompatibel med bildframställning fasta celler. För dessa observationer rekommenderas att göra gelen på ett täckskydd, färga cellerna, limma täcket på en bild och först därefter lägga till monteringsmedia och en annan täckbild. Observation kommer sedan att ske med gelen på toppen för att undvika nedbrytning av bilden genom gelen.

Möjliga fallgropar är variabiliteten i gel i polymerisering och beläggning. Polymerisationsproblem beror främst på kvaliteten på initiator/katalysator. Även gelen kan blåsa upp, särskilt om den inte används direkt efter montering. Detta problem verkar inte dramatiskt påverka gelens mekaniska egenskaper, men det kan göra pärlskiktet oantagbart för målet, vilket effektivt gör gelen värdelös. Vi rekommenderar att man förbereder extra geler för varje tillstånd när detta problem visas. Det kan också finnas en viss variation i beläggningen, och det är viktigt att ha nyligen utspädd Sulfo SANPAH.

Sammanfattningsvis har vi beskrivit en enkel, billig och reproducerbar metod för att mäta de krafter som utövas av B-celler vid den immunologiska synapsen när den aktiveras av BCR ligand. Den kan anpassas för att studera reaktionen på andra ligander och andra sorters lymfocyter (minnes B-celler, T-celler etc.) med användning av den rätta receptor liganden.

Materials

3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS)	Sigma-Aldrich	281778	Store aliquoted, protected from humidity
40% Acrylamide Solution	Biorad	1610140
Alexa555 microscale protein labeling kit	Molecular Probes	A30007
Ammonium Persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
B cell Isolation Kit, Mouse	Miltenyi Biotec	130-090-862
B-mercaptoethanol	Gibco	31350-010
2% Bis Solution	Biorad	161-0142
Bovine Serum Albumin (BSA)	Euromedex	04-100-812-C
Coverslip 18mm	VWR	631-1580
Fetal calf serum	PAA	A15-151	Decomplemented (40min @56°C)
Fluorodishes FD35	World Precision Instruments, Inc	FD35100
Fluosphere: carboxylate-modified, 0.2um, dark red	Molecular Probes	F8807
Hen Egg Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876	Stocked in aliquote 100mg/ml
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Thermofisher/Gibco	11140035
N,N,N',N'-tetrametiletilendiammine (TEMED)	Euromedex	50406-B
PBS (Phosfate Buffer Saline)	Gibco	10010-015
Penicillin–streptomycin	Gibco	15140-010
RMPI 1640 – Glutamax I	Thermofisher	61870-010
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2
Sodium pyruvate	Gibco	11360-039
sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH)	Thermo Scientific	22589