मानव तंत्रिका जनक सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के साथ एक न्यूराइट आउटग्रोथ परख और न्यूरोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन
Summary
प्रस्तुत प्रोटोकॉल छोटे अणु यौगिकों के एक न्यूराइट आउटग्रोथ परख और न्यूरोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन के लिए एक विधि का वर्णन करता है।
Abstract
न्यूराइट आउटग्रोथ परख और न्यूरोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन दो प्रमुख अध्ययन हैं जिन्हें यहां प्रस्तुत विधि का उपयोग करके किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल न्यूरोनल आकृति विज्ञान का विश्वसनीय विश्लेषण प्रदान करता है जिसमें न्यूराइट लंबाई और सिनैप्टिक प्रोटीन स्थानीयकरण पर संशोधनों के मात्रात्मक माप और छोटे अणु यौगिकों के साथ उपचार पर बहुतायत है। न्यूराइट आउटग्रोथ अध्ययनों में प्रस्तुत विधि के आवेदन के अलावा, न्यूरोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन उनके संभावित विकासात्मक न्यूरोटॉक्सिसिटी प्रभाव के आधार पर वाणिज्यिक रासायनिक यौगिकों का आकलन, अंतर और रैंक करने के लिए किया जा सकता है।
हालांकि सेल लाइनों आजकल व्यापक रूप से तंत्रिका विज्ञान में यौगिक स्क्रीनिंग परख में उपयोग किया जाता है, वे अक्सर आनुवंशिक रूप से और उनके ऊतक मूल से phenotypically अलग । दूसरी ओर, प्राथमिक कोशिकाएं वीवो में देखे गए महत्वपूर्ण मार्कर और कार्यों को बनाए रखते हैं। इसलिए, अनुवाद क्षमता और शारीरिक प्रासंगिकता के कारण कि ये कोशिकाएं न्यूराइट आउटग्रोथ परख की पेशकश कर सकती हैं और न्यूरोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन प्राथमिक मानव कोशिका मॉडल के रूप में मानव तंत्रिका जनक कोशिकाओं (एचपीपीसी) का उपयोग करने से काफी लाभान्वित हो सकता है।
प्रस्तुत विधि यहां यौगिकों की क्षमता के लिए स्क्रीन करने के लिए मानव तंत्रिका जनक कोशिका व्युत्पन्न न्यूरॉन्स, एक सेल मॉडल बारीकी से मानव जीव विज्ञान का प्रतिनिधित्व का लाभ लेने के द्वारा न्यूराइट आउटग्रोथ और न्यूरोटॉक्सिसिटी प्रेरित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
Introduction
न्यूराइट विकास न्यूरोनल नेटवर्क और तंत्रिका उत्थान के गठन के लिए मौलिक प्रक्रिया है1, 2,2. एक चोट के बाद, न्यूराइट आउटग्रोथ तंत्रिका तंत्र के उत्थान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों और न्यूरोनल,इंजरी3,4,,5,6के परिणामों को बढ़ाने के लिए न्यूरोनल पुनर्योजी गतिविधियों को प्रेरित करने में न्यूराइट आउटग्रोथ भी एक महत्वपूर्ण तत्व है ।
विभिन्न तंत्रिका वंश के उत्पादन में उनकी भेदभाव क्षमता को बनाए रखकर, मानव तंत्रिका जनक कोशिकाएं (एचपीपीसी) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) कार्य,और विकास7,8,9के अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रणाली प्रदान कर सकती हैं।, प्राथमिक मानव कोशिका मॉडल के रूप में एचएनपीसी की उच्च अनुवादात्मक क्षमता और शारीरिक प्रासंगिकता न्यूराइट आउटग्रोथ से संबंधित दवा खोज स्क्रीनिंग में काफी लाभ प्रदान करती है। हालांकि, उच्च थ्रूपुट परख के लिए प्राथमिक सेल मॉडलों का रखरखाव और स्केलिंग समय लेने वाली और श्रम-प्रधान10, 11,,12,,,13हो सकती है।12
न्यूराइट आउटग्रोथ अध्ययनों में प्रस्तुत विधि के आवेदन के अलावा, न्यूरोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन एचएनपीसी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स का उपयोग करके एक और आवेदन है। हजारों वाणिज्यिक रासायनिक यौगिक हैं जो या तो जांच नहीं की जाती हैं या खराब समझ में आई न्यूरोटॉक्सिटी क्षमता के साथ। इसलिए, विकासात्मक न्यूरोटॉक्सिकिटी को प्रकाश में लाने की उनकी क्षमता के आधार पर मूल्यांकन, अंतर और रैंक यौगिकों का आकलन, अंतर और रैंक यौगिकों के लिए अधिक विश्वसनीय और प्रभावी स्क्रीनिंग प्रयोग उच्च मांग14में है। पर्यावरण में अपरीक्षित यौगिकों की प्रचुरता के साथ – साथ न्यूरोलॉजिकल विकारों की व्यापकता और घटनाओं में वृद्धि के लिए खतरनाक पर्यावरणीय यौगिकों की पहचान करने के लिए अधिक भरोसेमंद और कुशल प्रयोगों का विकास आवश्यक है जो न्यूरोटॉक्सिसिटी15पैदा कर सकते हैं ।
प्रस्तुत विधि का उपयोग मानव तंत्रिका जनक कोशिका-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स का लाभ उठाकर यौगिकों की क्षमता के लिए स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है, जो मानव जीवविज्ञान का बारीकी से प्रतिनिधित्व करने वाला एक सेल मॉडल है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल परीक्षण यौगिकों के साथ उपचार पर न्यूराइट लंबाई के लिए परीक्षण का वर्णन करने वाले कुछ प्रकाशित कागजात में से एक है। इसके अलावा, हम वर्णन करते हैं कि न्यूराइट आउटग्रोथ परख और न्यूरोटॉक्सिस?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को एमएएफ को दिए गए निमाड रिसर्च ग्रांट (940714) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 – minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1℃/minute cell freezing in a -80℃ freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly‐L‐lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
Referências
- Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
- Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).
- Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
- Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
- Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
- Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
- Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
- Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
- Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
- An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).
- Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
- Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer’s disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer’s Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
- Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
- Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
- Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
- Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).
- Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
- Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
- Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).
