Un saggio di escrescenza Neurite e una valutazione della neurotossicità con neuroni derivati dalla cellula del progenitore neurale umano
Summary
Il protocollo presentato descrive un metodo per un saggio di escrescenza neurite e la valutazione della neurotossicità di piccoli composti molecolari.
Abstract
Neurite analisi di escrescenza e la valutazione della neurotossicità sono due studi principali che possono essere eseguiti utilizzando il metodo presentato qui. Questo protocollo fornisce un’analisi affidabile della morfologia neuronale insieme alle misurazioni quantitative delle modifiche sulla lunghezza dei neuriti e sulla localizzazione delle proteine sinaptiche e sull’abbondanza al trattamento con piccoli composti molecolari. Oltre all’applicazione del metodo presentato negli studi sulla neurite outgrowth, la valutazione della neurotossicità può essere eseguita per valutare, distinguere e classificare i composti chimici commerciali in base al loro potenziale effetto di neurotossicità dello sviluppo.
Anche se le linee cellulari sono oggi ampiamente utilizzate nei saggi di screening composto nelle neuroscienze, spesso differiscono geneticamente e fenotipicamente dalla loro origine tissutale. Le cellule primarie, d’altra parte, mantengono importanti marcatori e funzioni osservate in vivo. Pertanto, a causa del potenziale di traduzione e rilevanza fisiologica che queste cellule potrebbero offrire analisi di crescita neurite e la valutazione della neurotossicità possono notevolmente beneficiare dell’utilizzo di cellule progenitrici neurali umane (hNPC) come modello cellulare umano primario.
Il metodo presentato qui può essere utilizzato per lo screening per la capacità dei composti di indurre la crescita di neurite e neurotossicità sfruttando i neuroni derivati dalla cellula progenitore neurale umano, un modello cellulare che rappresenta da vicino la biologia umana.”
Introduction
La crescita di Neurite è un processo fondamentale per la formazione della rete neuronale e la rigenerazione del nervo1,2. A seguito di un infortunio, la crescita dei neuriti svolge un ruolo chiave nella rigenerazione del sistema nervoso. L’escrescenza di Neurite è anche un elemento importante della segnalazione extracellulare nell’indurre attività rigenerative neuronali per migliorare i risultati per disturbi neurodegenerativi e lesioni neuronali3,4,5,6.
Mantenendo il loro potenziale di differenziazione nella produzione di vari lignaggi neurali, le cellule progenitrici neurali umane (hNMC) potrebbero fornire un sistema modello per gli studi sulla funzione del sistema nervoso centrale (CNS) e sullo sviluppo7,8,9. L’elevato potenziale traslazionale e la rilevanza fisiologica degli hNMC come modello primario di cellule umane offrono un notevole vantaggio negli screening di scoperti di farmaci legati alla crescita neurite. Tuttavia, la manutenzione e il ridimensionamento dei modelli cellulari primari per i test ad alto consumo potrebbero richiedere molto tempo e molta mano doperante10,11,12,13.
Oltre all’applicazione del metodo presentato negli studi sulla neurite outgrowth, la valutazione della neurotossicità è un’altra applicazione che utilizza i neuroni derivati dall’hNPC. Ci sono migliaia di composti chimici commerciali che non vengono esaminati o con un potenziale di neurotossicità poco compreso. Pertanto, esperimenti di screening più affidabili ed efficaci per valutare, distinguere e classificare i composti in base al loro potenziale di provocare neurotossicità dello sviluppo è molto richiesto14. L’aumento della prevalenza e dell’incidenza di disturbi neurologici insieme all’abbondanza di composti non testati nell’ambiente richiede lo sviluppo di esperimenti più affidabili ed efficienti per identificare composti ambientali pericolosi che possono rappresentare la neurotossicità15.
Il metodo presentato qui può essere utilizzato per lo screening per la capacità dei composti di indurre neurite ecrescita e neurotossicità sfruttando i neuroni derivati dalla cellula progenitore neurale umano, un modello cellulare che rappresenta da vicino la biologia umana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo è uno dei pochi articoli pubblicati che descrivono il test per la lunghezza della neurite al trattamento con composti di prova. Inoltre, descriviamo come utilizzare gli hNPC per un saggio di escrescenza di neurite e una valutazione della neurotossicità. Utilizzando questa valutazione di analisi e neurotossicità della neurite e della neurotossicità sui neuroni derivati dagli hNFC, il potenziale neurogenico di una categoria di composti epigenetici di piccole molecole, inibitori HDAC, nell’indurre la c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata dalla borsa di ricerca NIMAD (940714) assegnata al MAF.
Materials
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 – minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1℃/minute cell freezing in a -80℃ freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly‐L‐lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
Referências
- Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
- Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).
- Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
- Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
- Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
- Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
- Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
- Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
- Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
- An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).
- Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
- Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer’s disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer’s Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
- Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
- Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
- Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
- Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).
- Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
- Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
- Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).
