神経前駆細胞由来ニューロンを用いた神経突起増殖アッセイと神経毒性評価
1Department of Molecular Genetics, Faculty of Biological Sciences,Tarbiat Modares University, 2Center for Therapeutic Innovation and Department of Psychiatry & Behavioral Sciences,University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology,University of Miami Miller School of Medicine, 4Persian BayanGene Research and Training Center
Summary
提示されたプロトコルは、低分子化合物の神経突起成長アッセイおよび神経毒性評価のための方法を記述する。
Abstract
神経突起伸長アッセイおよび神経毒性評価は、本明細書において提示された方法を用いて行うことができる2つの主要な研究である。このプロトコルは、神経形態の信頼性の高い分析と、低分子化合物による治療時の神経突起長およびシナプスタンパク質の局在化および豊富さの修飾の定量的測定を提供します。神経突起伸長研究における提示方法の適用に加えて、神経毒性評価は、潜在的な発達神経毒性効果に基づいて市販の化学化合物を評価、区別、およびランク付けするために行うことができる。
細胞株は今日、神経科学における複合スクリーニングアッセイで広く使用されているが、それらはしばしばその組織起源とは遺伝的および表現的に異なる。一方、初等細胞は、生体内で観察される重要なマーカーおよび機能を維持する。したがって、これらの細胞が神経突起の成長アッセイや神経毒性評価を提供できる翻訳ポテンシャルと生理学的関連性のために、ヒト神経前駆細胞(hNPC)を一次ヒト細胞モデルとして使用することで大きな利益を得ることができます。
本明細書で提示される方法は、ヒトの神経前駆細胞由来ニューロンを利用して神経突起の伸びおよび神経毒性を誘導する化合物の能力をスクリーニングするために利用することができる、ヒト生物学を密接に表す細胞モデルである。
Introduction
神経突起増殖は、神経ネットワークと神経再生11,22の形成の基礎となるプロセスである。損傷後、神経突起の成長は神経系の再生に重要な役割を果たす。神経突起伸長は、神経変性疾患および神経損傷の結果を増強する神経細胞再生活動を誘導する細胞外シグナル伝達の重要な要素でもある33、4、5、6。4,5,6
様々な神経系統を産生する際の分化の可能性を維持することにより、ヒト神経前駆細胞(hNPC)は、中枢神経系(CNS)機能および開発77、8、98の研究のためのモデルシステムを9提供することができる。ヒト細胞モデルとしてのhNPCの高い翻訳ポテンシャルおよび生理学的関連性は、神経突起成長関連の創薬スクリーニングにおいてかなりの利点を提供する。しかし、高スループットアッセイ用のプライマリセルモデルのメンテナンスとスケーリングは、時間がかかり、10、11、12、1311,12,13の労働集約的な可能性があります。10
神経突起伸長研究における提示方法の適用に加えて、神経毒性評価は、hNPC由来のニューロンを用いた別のアプリケーションである。検査されていないか、または十分に理解されていない神経毒性の可能性を持つ市販の化学化合物の数千があります。.したがって、より信頼性が高く、より効果的なスクリーニング実験は、発達神経毒性を引き起こす可能性に基づいて化合物を評価、区別、およびランク付けする、高い需要14である。環境中の未試験化合物の豊富と共に神経疾患の有病率および発生率の増加は、神経毒性を引き起こす可能性のある有害な環境化合物を同定するためのより信頼できる効率的な実験の開発を必要とする15。
本明細書において提示される方法は、ヒトの神経前駆細胞由来ニューロンを利用して神経突起の伸長および神経毒性を誘導する化合物の能力をスクリーニングするために利用することができる、ヒト生物学を密接に表す細胞モデルである。
Protocol
倫理声明:胎児標本は、国立衛生研究所(NIH)が支援する組織分布プログラムを通じて、シアトルのワシントン大学の出生時欠損研究所から受け取られました。出生時欠損研究所は両親から適切な書面によるインフォームド・コンセントを得て、組織の調達はワシントン大学の機関審査委員会によって監視されました。すべての作業は、マイアミ大学8の人間の主題研究事務所の…
Representative Results
原稿に記載されているプロトコルは、最近発表された22、23,23の論文でうまく使われています。図3は、低分子化合物の神経突起の伸びとそれに続く神経形成能力のマーカーとしてのエピジェネティック化合物としてのHDAC阻害剤の効果を調べるhNPC由来ニューロンの使用を示す。 さらに、図4<…
Discussion
このプロトコルは、試験化合物による処理時の神経突起長の試験について説明する数少ない公表された論文の1つである。さらに、神経突起の成長アッセイや神経毒性評価にhNPCを用いる方法について述べています。hNPC由来ニューロンに対するこの神経突起伸長アッセイおよび神経毒性評価を利用することにより、エピジェネティックな低分子化合物のカテゴリーの神経因性ポテンシャル、HDAC…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、MAFに授与されたNIMAD研究助成金(940714)によって資金提供されました。
Materials
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 – minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1℃/minute cell freezing in a -80℃ freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly‐L‐lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
Referências
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Citar este artigo
Bagheri, A., Razavipour, S. F., Wahlestedt, C., Mowla, S. J., Faghihi, M. A. A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons. J. Vis. Exp. (162), e60955, doi:10.3791/60955 (2020).