En Neurite Utväxt analys och neurotoxicitet bedömning med mänskliga neurala stamceller cell-härledda nervceller
Summary
Det presenterade protokollet beskriver en metod för en neurite utväxt analys och neurotoxicitet bedömning av små molekylföreningar.
Abstract
Neurite utväxt analys och neurotoxicitet bedömning är två stora studier som kan utföras med den presenterade metoden häri. Detta protokoll ger tillförlitlig analys av neuronal morfologi tillsammans med kvantitativa mätningar av modifieringar på neurit längd och synaptisk protein lokalisering och överflöd vid behandling med små molekylföreningar. Förutom tillämpningen av den presenterade metoden i neurite utväxt studier, neurotoxicitet bedömning kan utföras för att bedöma, särskilja och rangordna kommersiella kemiska föreningar baserat på deras potentiella utvecklingsmässiga neurotoxicitet effekt.
Även om cellinjer numera används i stor utsträckning i sammansatta screening analyser i neurovetenskap, de skiljer sig ofta genetiskt och fenotypiskt från deras vävnad ursprung. Primära celler, å andra sidan, upprätthålla viktiga markörer och funktioner som observerats in vivo. Därför, på grund av översättningen potential och fysiologiska relevans att dessa celler kan erbjuda neurite utväxt analys och neurotoxicitet bedömning kan avsevärt dra nytta av att använda mänskliga neurala stamceller (hNPCs) som den primära mänskliga cellen modell.
Den presenterade metoden häri kan användas för att skärmen för förmågan hos föreningar att inducera neurite utväxt och neurotoxicitet genom att dra nytta av den mänskliga neurala föregångaren cell-härledda nervceller, en cellmodell som nära representerar mänsklig biologi.”
Introduction
Neurit tillväxt är en process grundläggande för bildandet av neuronala nätverk och nerv regenerering1,2. Efter en skada, neurite utväxt spelar en nyckelroll i förnyelse av nervsystemet. Neurite utväxt är också en viktig del av den extracellulära signalering i inducera neuronala regenerativ verksamhet för att förbättra resultaten för neurodegenerativa sjukdomar och neuronal skada3,,4,5,6.
Genom att bibehålla deras differentieringspotential när det gäller att producera olika neurala härstamningar kan mänskliga neurala stamceller (hNPCs) tillhandahålla ett modellsystem för studier av centrala nervsystemet (CNS) funktion och utveckling7,8,9. Hög translationell potential och fysiologiska relevans hNPCs som en primär mänsklig cell modell erbjuder en betydande fördel i neurite utväxt-relaterade missbruk upptäckt screenings. Underhåll och skalning av de primära cellmodellerna för analyser med högt genomströmning kan dock vara tidskrävande och arbetsintensivt10,11,12,13.
Förutom tillämpningen av den presenterade metoden i neurite utväxt studier, neurotoxicitet bedömning är ett annat program med hNPC-härledda nervceller. Det finns tusentals kommersiella kemiska föreningar som antingen inte undersöks eller med dåligt förstådd neurotoxicitet potential. Därför är mer tillförlitliga och effektiva screening experiment för att bedöma, skilja och rangordna föreningar baserat på deras potential att framkalla utvecklingsneurotoxicitet i hög efterfrågan14. Ökningen av prevalens och incidens av neurologiska sjukdomar tillsammans med överflödet av oprövade föreningar i miljön kräver utveckling av mer pålitliga och effektiva experiment för att identifiera farliga miljöföreningar som kan utgöra neurotoxicitet15.
Den presenterade metoden häri kan användas för att skärmen för förmågan hos föreningar att inducera neurite utväxt och neurotoxicitet genom att dra nytta av den mänskliga neurala föregångaren cell-härledda nervceller, en cellmodell som nära representerar mänsklig biologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll är en av de få publicerade artiklar som beskriver testet för neurite längd vid behandling med testföreningar. Dessutom beskriver vi hur man använder hNPCs för en neurite utväxt analys och neurotoxicitet bedömning. Genom att använda denna neurite utväxt analys och neurotoxicitet bedömning på hNPCs-härledda nervceller, den neurogena potentialen hos en kategori av epigenetiska små molekylföreningar, HDAC-hämmare, för att inducera neurit utväxt visas22. Dessutom, i e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning finansierades av NIMAD forskningsanslag (940714) som tilldelats MAF.
Materials
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 – minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1℃/minute cell freezing in a -80℃ freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly‐L‐lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
Referências
- Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
- Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).
- Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
- Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
- Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
- Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
- Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
- Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
- Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
- An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).
- Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
- Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer’s disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer’s Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
- Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
- Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
- Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
- Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).
- Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
- Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
- Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).
