Anpassbarer winkelster stereotaktischer Ansatz für vielseitige neurowissenschaftliche Techniken
Summary
Hier wird ein stereotaktisches Verfahren beschrieben, das mit einem abgewinkelten koronalen Ansatz auf herausfordernde und schwer zugängliche Hirnregionen (aufgrund räumlicher Einschränkungen) abzielen kann. Dieses Protokoll ist sowohl an Maus- als auch an Rattenmodelle anpassbar und kann auf verschiedene neurowissenschaftliche Anwendungen angewendet werden, einschließlich Kanülenimplantation und Mikroinjektionen viraler Konstrukte.
Abstract
Stereotaktische Chirurgie ist ein wesentliches Werkzeug im modernen neurowissenschaftlichen Labor. Die Fähigkeit, schwer erreichbare Hirnregionen präzise und genau anzusprechen, stellt jedoch immer noch eine Herausforderung dar, insbesondere wenn gehirne Strukturen entlang der Mittellinie anvisiert werden. Zu diesen Herausforderungen gehören die Vermeidung des oberen sagittalen Sinus und des dritten Ventrikels sowie die Fähigkeit, selektive und diskrete Gehirnkerne konsequent anzusprechen. Darüber hinaus beruhen fortgeschrittenere neurowissenschaftliche Techniken (z. B. Optogenetik, Faserphotometrie und Zwei-Photonen-Bildgebung) auf der gezielten Implantation signifikanter Hardware in das Gehirn, und räumliche Einschränkungen sind ein häufiges Hindernis. Hier wird ein modifizierbares Protokoll für das stereotaktische Targeting von Nagetier-Gehirnstrukturen mit einem abgewinkelten koronalen Ansatz vorgestellt. Es kann an 1) Maus- oder Rattenmodelle, 2) verschiedene neurowissenschaftliche Techniken und 3) mehrere Gehirnregionen angepasst werden. Als repräsentatives Beispiel umfasst es die Berechnung stereotaktischer Koordinaten für das Targeting des hypothalamischen ventromedialen Kerns der Maus (VMN) für ein optogenetisches Inhibitionsexperiment. Dieses Verfahren beginnt mit der bilateralen Mikroinjektion eines Adeno-assoziierten Virus (AAV), das einen lichtempfindlichen Chloridkanal (SwiChR++) zu einem Cre-abhängigen Mausmodell kodiert, gefolgt von der abgewinkelten bilateralen Implantation von faseroptischen Kanülen. Mit diesem Ansatz zeigen die Ergebnisse, dass die Aktivierung einer Untergruppe von VMN-Neuronen für intakte Glukose-Gegenregelreaktionen auf insulininduzierte Hypoglykämie erforderlich ist.
Introduction
Die neuronale Steuerung von Verhalten, Fütterung und Stoffwechsel beinhaltet die Koordination hochkomplexer, integrativer und redundanter Neuroschaltkreise. Ein treibendes Ziel der Neurowissenschaften ist es, die Beziehung zwischen neuronaler Schaltkreisstruktur und -funktion zu analysieren. Obwohl klassische neurowissenschaftliche Werkzeuge (d. H. Läsionierung, lokale pharmakologische Injektionen und elektrische Stimulation) wichtiges Wissen über die Rolle bestimmter Gehirnregionen, die Verhalten und Stoffwechsel steuern, aufgedeckt haben, sind diese Werkzeuge durch ihre mangelnde Spezifität und Reversibilität begrenzt1.
Jüngste Fortschritte im Bereich der Neurowissenschaften haben die Fähigkeit, die Schaltungsfunktion zelltypspezifisch mit hoher raumzeitlicher Auflösung abzufragen und zu manipulieren, erheblich verbessert. Optogenetische2- und chemogenetische3-Ansätze ermöglichen beispielsweise die schnelle und reversible Manipulation der Aktivität in genetisch definierten Zelltypen frei beweglicher Tiere. Optogenetik beinhaltet die Verwendung von lichtempfindlichen Ionenkanälen, sogenannten Channelrhodopsinen, zur Steuerung der neuronalen Aktivität. Der Schlüssel zu dieser Technik ist die Genabgabe von Channelrhodopsin und einer Lichtquelle zur Aktivierung des Opsins. Eine gängige Strategie für die Genabgabe ist eine Kombination aus 1) gentechnisch veränderten Mäusen, die Cre-Recombinase in diskreten Neuronen exprimieren, und 2) Cre-abhängigen viralen Vektoren, die Channelrhodopsin kodieren.
Während die Optogenetik ein elegantes, hochpräzises Mittel zur Kontrolle der neuronalen Aktivität bietet, ist die Methode von einer erfolgreichen stereotaktischen Mikroinjektion des viralen Vektors und der faseroptischen Platzierung in einer definierten Gehirnregion abhängig. Obwohl stereotaktische Verfahren im modernen neurowissenschaftlichen Labor üblich sind (und es gibt mehrere ausgezeichneteProtokolle,die dieses Verfahren beschreiben)4,5,6, stellt die Fähigkeit, diskrete Hirnregionen entlang der Mittellinie (d.h. den mediobasalen Hypothalamus, ein für die Regulation homöostatischer Funktionen kritisches Hirnareal7)konsistent und reproduzierbar anzusprechen, zusätzliche Herausforderungen dar. Zu diesen Herausforderungen gehören die Vermeidung des oberen sagittalen Sinus, des dritten Ventrikels und der angrenzenden hypothalamischen Kerne. Darüber hinaus gibt es erhebliche räumliche Einschränkungen bei der bilateralen Implantation von Hardware, die für Hemmungsstudien erforderlich ist. Mit diesen Herausforderungen im Hinterkopf stellt dieses Protokoll ein modifizierbares Verfahren dar, um diskrete Gehirnregionen über einen abgewinkelten stereotaktischen Ansatz anzusprechen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jüngste Fortschritte in den Neurowissenschaften haben fortgeschrittene Einblicke und Verständnis für die Aktivität und Funktion von Gehirnneuroschaltkreisen unterstützt. Dazu gehört die Anwendung optogenetischer und chemogenetischer Technologien zur Aktivierung oder Stille diskreter neuronaler Populationen und ihrer Projektionsstellen in vivo. In jüngerer Zeit wurden gentechnisch kodierte Calciumindikatoren (z. B. GCaMP, RCaMP) und andere fluorometrische Biosensoren (z. B. Dopamin, Noradrenalin) zur in vivo-Aufzei…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Stipendien des National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M.), einen American Diabetes Association Innovative Basic Science Award (#1-19-IBS-192 an G.J.M.) und das NIDDK-finanzierte Nutrition Obesity Research Center (DK-035816), Diabetes Research Center (DK-017047) und Diabetes, Adipositas und Stoffwechsel Training Grant T32 DK0007247 (T.H.M) an der University of Washington.
Materials
| Fiberoptic Cannulae | Doric Lenses | MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT | Customizable |
| Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System | Kopf | Model 1900 | |
| Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge | Kopf | Model 1900-51 | |
| Kopf Model 1905 Alignment Indicator | Kopf | Model 1905 | |
| Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1911 | |
| Kopf Model 1915 Centering Scope | Kopf | Model 1915 | |
| Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 1922 | |
| Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 1923-B | |
| Kopf Model 1940 Micro Manipulator | Kopf | Model 1940 | |
| Micro4 Microinjection System | World Precision Instruments | — | |
| Mouse bone screws | Plastics One | 00-96 X 1/16 | |
| Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule | Thor Labs | XCL | |
| Surgical Drill | Cell Point Scientific | Ideal Micro Drill |
Referências
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