Tilpasningsdyktig vinklet stereotaktisk tilnærming for allsidige nevrovitenskapsteknikker

Summary

Beskrevet her er en stereotaktisk prosedyre som kan målrette utfordrende og vanskelig tilgjengelige hjerneregioner (på grunn av romlige begrensninger) ved hjelp av en vinklet koronar tilnærming. Denne protokollen er tilpasningsdyktig til både mus- og rottemodeller og kan brukes på forskjellige nevrovitenskapelige applikasjoner, inkludert kanyleimplantasjon og mikroinjeksjoner av virale konstruksjoner.

Abstract

Stereotaktisk kirurgi er et viktig verktøy i det moderne nevrovitenskapslaboratoriet. Evnen til å målrette mot vanskelige hjerneregioner er imidlertid fortsatt en utfordring, spesielt når man retter seg mot hjernestrukturer langs midtlinjen. Disse utfordringene inkluderer å unngå den overlegne skytten sinus og tredje ventrikel og evnen til konsekvent å målrette selektive og diskrete hjernekjerner. I tillegg er mer avanserte nevrovitenskapelige teknikker (f.eks. optogenetikk, fiberfotometri og to-fotonavbildning) avhengige av målrettet implantasjon av betydelig maskinvare til hjernen, og romlige begrensninger er en vanlig hindring. Presentert her er en modifiserbar protokoll for stereotaktisk målretting av gnagerhjernestrukturer ved hjelp av en vinklet koronal tilnærming. Det kan tilpasses 1) mus- eller rottemodeller, 2) ulike nevrovitenskapsteknikker og 3) flere hjerneregioner. Som et representativt eksempel inkluderer det beregning av stereotaktiske koordinater for målretting av musen hypothalamus ventromedial kjerne (VMN) for et optogenetisk hemmingseksperiment. Denne prosedyren begynner med bilateral mikroinjeksjon av et adeno-assosiert virus (AAV) som koder en lysfølsom kloridkanal (SwiChR ++) til en Cre-avhengig musemodell, etterfulgt av vinklet bilateral implantasjon av fiberoptisk kanyle. Ved hjelp av denne tilnærmingen viser funn at aktivering av en undergruppe av VMN-nevroner er nødvendig for intakt glukose kontraregulatorisk respons på insulinindusert hypoglykemi.

Introduction

Nevral kontroll av atferd, fôring og metabolisme innebærer koordinering av svært komplekse, integrative og overflødige nevrokretser. Et drivende mål for nevrovitenskapsfeltet er å dissekere forholdet mellom nevronal kretsstruktur og funksjon. Selv om klassiske nevrovitenskapelige verktøy (dvs. lesjon, lokale farmakologiske injeksjoner og elektrisk stimulering) har avdekket viktig kunnskap om rollen til spesifikke hjerneregioner som kontrollerer atferd og metabolisme, er disse verktøyene begrenset av deres mangel på spesifisitet og reversibilitet¹.

Nylige fremskritt innen nevrovitenskap har forbedret evnen til å forhøre og manipulere kretsfunksjonen på en cellespesifikk måte med høy romlig oppløsning. Optogenetiske^2- og kjemogenetiske^{3-tilnærminger,} for eksempel, tillater rask og reversibel manipulering av aktivitet i genetisk definerte celletyper av fritt bevegelige dyr. Optogenetikk innebærer bruk av lysfølsomme ionkanaler, kalt channelrhodopsins, for å kontrollere nevronaktivitet. Nøkkelen til denne teknikken er genlevering av channelrhodopsin og en lyskilde for å aktivere opsin. En vanlig strategi for genlevering er gjennom en kombinasjon av 1) genmodifiserte mus som uttrykker Cre-rekombininase i diskrete nevroner, og 2) Cre-avhengige virale vektorer som koder channelrhodopsin.

Mens optogenetikk gir en elegant, svært presis måte å kontrollere nevronaktivitet, metoden er betinget av vellykket stereotaktisk mikroinjeksjon av viral vektor og fiberoptisk plassering i en definert hjerneregion. Selv om stereotaktiske prosedyrer er vanlig i det moderne nevrovitenskapslaboratoriet (og det er flere gode protokoller som beskriver denne prosedyren)^4,5,6, å kunne konsekvent og reprodusere diskrete hjerneregioner langs midtlinjen (dvs. middelmådig hypothalamus, et hjerneområde som er kritisk for reguleringen av homeostatiske funksjoner⁷) gir ytterligere utfordringer. Disse utfordringene inkluderer å unngå den overlegne skytten sinus, tredje ventrikel og tilstøtende hypothalamuskjerner. I tillegg er det betydelige romlige begrensninger for bilateral implantasjon av maskinvare som kreves for hemmingsstudier. Med disse utfordringene i tankene presenterer denne protokollen heri en modifiserbar prosedyre for å målrette diskrete hjerneregioner via en vinklet stereotaktisk tilnærming.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent i samsvar med National Institutes of Health, Guide for the Care and Use of Animals og ble godkjent av både Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og Environmental Health and Safety ved University of Washington. 1. Beregning av vinklede koordinater Bruk et koronal hjerneatlas, merk en høyre trekant slik at hypotenusen passerer gjennom målområdet av interesse. I det representative eksemplet (figur 1) er den hyp…

Representative Results

Denne protokollen beskriver en kirurgisk prosedyre for å utføre optogenetikkstudier for å forhøre rollen som hypothalamus VMN-nevroner i glykemisk kontroll9. Først brukt var en standard (ikke-vinklet) stereotaktisk tilnærming for bilateral mikroinjeksjon av en hemmende channelrhodopsin virus til VMN. Selv om en vinklet tilnærming også ville være egnet, ble standard (ikke-vinklet) tilnærming valgt fordi den er tilstrekkelig til å målrette hjerneregionen av interesse og er en enkel, pål…

Discussion

Nylige fremskritt innen nevrovitenskap har støttet avansert innsikt og forståelse av aktiviteten og funksjonen til hjerne nevrokretser. Dette inkluderer anvendelsen av optogenetiske og kjemogenetiske teknologier for å aktivere eller kneble diskrete nevronpopulasjoner og deres projeksjonssteder in vivo. Mer nylig har dette inkludert utviklingen av genetisk kodede kalsiumindikatorer (f.eks. GCaMP, RCaMP) og andre fluorometriske biosensorer (f.eks. dopamin, noradrenalin) for in vivo-registrering av nevronaktivitet i en d…

Materials

Fiberoptic Cannulae	Doric Lenses	MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT	Customizable
Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System	Kopf	Model 1900
Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge	Kopf	Model 1900-51
Kopf Model 1905 Alignment Indicator	Kopf	Model 1905
Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill	Kopf	Model 1911
Kopf Model 1915 Centering Scope	Kopf	Model 1915
Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars	Kopf	Model 1922
Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf	Model 1923-B
Kopf Model 1940 Micro Manipulator	Kopf	Model 1940
Micro4 Microinjection System	World Precision Instruments	—
Mouse bone screws	Plastics One	00-96 X 1/16
Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule	Thor Labs	XCL
Surgical Drill	Cell Point Scientific	Ideal Micro Drill