लेजर एब्लेशन जैविक प्रणालियों में पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से लागू तकनीक है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में लेजर एब्लेशन के लिए एक मानक लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोग और बाद में जेब्राफिश पार्श्व रेखा में इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं को पुनर्जीवित करने के बाद के समय-चूक इमेजिंग का वर्णन किया गया है।
बाल कोशिकाएं मशीनी कोशिकाएं हैं जो सुनने की भावना में मध्यस्थता करती हैं। ये कोशिकाएं मनुष्यों में नुकसान के बाद पुनर्जीवित नहीं होती हैं, लेकिन उन्हें स्वाभाविक रूप से गैर-स्तनधारी कशेरुकी जैसे जेब्राफिश में मंगाया जाता है। ज़ेब्राफ़िश पार्श्व रेखा प्रणाली संवेदी हेयर सेल पुनर्जनन की विशेषता के लिए एक उपयोगी मॉडल है। पार्श्व रेखा में हेयर सेल युक्त अंग शामिल होते हैं जिन्हें न्यूरोमास्ट कहा जाता है, जो इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं (INMCs) की एक स्ट्रिंग द्वारा एक साथ जुड़े हुए हैं। आईएनएमसी जनक कोशिकाओं के रूप में कार्य करते हैं जो विकास के दौरान नए न्यूरोमामेस्तों को जन्म देते हैं। आईएनएमसी सेल डेथ द्वारा बनाई गई पार्श्व लाइन प्रणाली में अंतराल की मरम्मत कर सकता है। एक विधि यहां एक पारंपरिक लेजर स्कैनिंग कंफोकल माइक्रोस्कोप और ट्रांसजेनिक मछली है कि INMCs में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त का उपयोग कर चयनात्मक INMC ablation के लिए वर्णित है । समय-चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग आईएमसी पुनर्जनन की निगरानी और अंतर बंद करने की दर निर्धारित करने के लिए किया जाता है। यह सेल एब्लेशन के लिए एक सुलभ प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है, जैसे कि एक उच्च-स्तरीय स्पंदित पराबैंगनी लेजर। एब्लेशन प्रोटोकॉल व्यापक हितों की सेवा कर सकता है, क्योंकि यह अतिरिक्त सेल प्रकारों के एब्लेशन के लिए उपयोगी हो सकता है, एक उपकरण सेट को नियोजित करता है जो पहले से ही कई उपयोगकर्ताओं के लिए उपलब्ध है। इस तकनीक से विभिन्न परिस्थितियों में और विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि से आईएनएससी पुनर्जनन के लक्षण वर्णन को और सक्षम बनाया जा सकेगा, जो संवेदी जनक कोशिका उत्थान की समझ को आगे बढ़ाएगा।
सबसे प्रगतिशील सुनवाई हानि के मूल में संवेदी बाल कोशिकाओं का विनाश निहित है, जो मस्तिष्क द्वारा पता लगाने योग्य तंत्रिका आवेगों में बाह्य श्रवण उत्तेजनाओं को स्थानांतरित करता है। कॉकलियर हेयर सेल डेथ स्थायी सुनवाई हानि का कारण बनता है, क्योंकि वयस्क स्तनधारियों में नुकसान के बाद इन कोशिकाओं को पुनर्जीवित करने की क्षमता की कमी होती है। इसके विपरीत, गैर-स्तनधारी कशेरुकी जैसे जेब्राफिश ध्वनिक आघात या ओटोटॉक्सिक अपमान से खोने वाली बाल कोशिकाओं को पुनर्जीवित कर सकते हैं। जेब्राफिश मैकेनोसेंसरी पार्श्व रेखा एक सरल और आसानी से छेड़छाड़ की गई अंग प्रणाली है जिसका उपयोग बाल कोशिका उत्थान का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है1,2,3.
पार्श्व रेखा में न्यूरोमास्ट नामक छोटे संवेदी पैच होते हैं, जो विकास के दौरान विस्तारित कोशिकाओं की एक स्ट्रिंग द्वारा जुड़े होते हैं जिन्हें इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं (आईएनएमसी) के रूप में जाना जाता है। नए बाल कोशिका युक्त अंगों को जन्म देने वाली स्पष्ट स्टेम कोशिकाओं के रूप में उनकी प्रजनन क्षमता को देखते हुए, आईएनएमसी का व्यवहार समुदाय4, 5के लिए बहुत रुचिरखताहै । INMCs से संबंधित अनुसंधान के अधिकांश पास Schwann कोशिकाओं द्वारा उनके प्रसार के दमन की विशेषता है कि पार्श्व लाइन तंत्रिका के आसपास लपेटो, W β nt के एक अवरोधक के माध्यम से होने की संभावना/ 6,7,8. जबकि आईएमसी प्रसार और नए न्यूरोमाट्स में भेदभाव के नियमन को अच्छी तरह से वर्णित किया गया है, एब्लेशन के बाद आईएमसी पुनर्विकास को नियंत्रित करने वाले तंत्र को स्पष्ट नहीं किया गया है। यह प्रोटोकॉल व्यक्तिगत INMCs को एब्लेटिंग करने और उनके बाद के पुनर्योजी व्यवहार का विश्लेषण करने के साधन के रूप में कार्य करता है।
बाल कोशिकाओं को नष्ट करने के लिए विभिन्न तरीकों, कोशिकाओं का समर्थन करने और पूरे न्यूरोमास्टा प्रकाशित किए गए हैं, साथ ही वसूली की निगरानी के तरीकों के साथ। रासायनिक एब्लेशन बालों की कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन अन्य पार्श्व रेखा सेल प्रकार9को हटाने के लिए CuSO4 जैसे जहरीले रसायनों की खुराक में काफी वृद्धि की जानी चाहिए। जबकि फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के तहत इलेक्ट्रोब्लेशन पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए आईएनएमसी को नष्ट करने का एक प्रभावी और सरल साधन है, इसलिए संकीर्ण रूप से लक्षित करना मुश्किल है और इसलिए, महत्वपूर्ण संपाश्र्वक क्षति का उत्पादन होने की संभावना है । नतीजतन, यह INMC-विशिष्ट व्यवहार10, 11के पहलुओं को मुखौटा कर सकताहै। लेजर एब्लेशन प्रोटोकॉल नियोजित किए गए हैं, लेकिन उन्हें औसत प्रयोगशाला या इमेजिंग सुविधा (यानी, उच्च स्तरीय स्पंदित यूवी लेजर12)में आवश्यक रूप से मौजूद विशेष उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित विधि को आम 405 एनएम लेजर के साथ आउटफिट किए गए किसी भी लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ किया जा सकता है, आमतौर पर इमेजिंग डीएपीआई और अन्य नीले फ्लोरोफोरस के लिए उपयोग किया जाता है। इस विधि का एक लाभ यह है कि कॉन्फोकल इमेजिंग किसी भी अतिरिक्त लेजर नियंत्रण प्रणाली को उलझाने या स्पंदित लेजर से लैस किसी अन्य माइक्रोस्कोप में स्थानांतरित किए बिना सेल क्षति से तुरंत पहले और बाद में किया जा सकता है।
जेब्राफिश रीढ़ की हड्डी13में न्यूरॉन्स को एब्लेटिंग करने के लिए इसी तरह की विधि का वर्णन किया गया है । हालांकि, पिछली विधि को सेल एब्लेशन के लिए एफआरएपी मॉड्यूल की आवश्यकता होती है, जो इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, विभिन्न सेल प्रकारों (यानी, ट्रांसजीन फ्लोरेसेंस की चमक, शरीर के भीतर गहराई, और सेल आकार) के विशिष्ट गुणों को देखते हुए, यह संभावना है कि उपयोग किए गए सेल प्रकार के आधार पर महत्वपूर्ण संशोधनों की आवश्यकता होगी। यहां विस्तृत प्रोटोकॉल अधिक सतही कोशिकाओं के लिए प्रभावी होने की संभावना है, जैसा कि एक ही विधि का उपयोग करके संवेदी बाल कोशिका एब्लेशन के प्रदर्शन द्वारा समर्थित है। इसके अलावा उल्लिखित एक पुनर्जनन परख के लिए ablation के बाद INMC वसूली दरों का आकलन है, जो ऊपर उल्लिखित अध्ययन की एक विशेषता नहीं थी ।
यहां विस्तृत लेजर-आधारित सेल एब्लेशन प्रोटोकॉल लेजर स्थितियों, प्री-एंड पोस्ट-एब्लेशन इमेजिंग, और टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी के अनुकूलन के माध्यम से आईएनएमसी की पुनर्योजी क्षमता को कैप्चर करता है। ये तत्व आईएमसी पुनर्विकास और गैप क्लोजर को अपनी संपूर्णता में व्यापक रूप से चित्रित करने के लिए एक साथ आते हैं। हालांकि इस प्रोटोकॉल का उपयोग यहां INMCs को नष्ट करने के लिए किया जाता है, इसे अन्य काम पर लागू किया जा सकता है जिसके लिए सेलुलर एब्लेशन के विश्वसनीय और प्रभावी मूल्यांकन की आवश्यकता होती है। यह एक सुलभ तकनीक भी है, क्योंकि इसे 405 एनएम लेजर से लैस किसी भी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर संचालित किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल लेजर सेल एब्लेशन के लिए एक बहुमुखी विधि का वर्णन करता है जिसे किसी भी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर किया जा सकता है जो निकट-पराबैंगनी लेजर (405 एनएम तरंगदैर्ध्य) से लैस है। यह प्रोटोकॉल इलेक्ट्रोब्लेशन (जो अधिक व्यापक क्षति11का कारण बनता है) और स्पंदित यूवी-लेजर एब्लेशन (जिसके लिए अतिरिक्त विशेष उपकरण12की आवश्यकता होती है) जैसे पहले से नियोजित तरीकों की सीमाओं को संबोधित करता है। पूर्व और बाद में एब्लेशन कॉन्फोकल इमेजिंग प्रयोग की सफलता के बारे में तेजी से प्रतिक्रिया प्रदान करते हैं। बाद के समय-चूक माइक्रोस्कोपी संवेदी प्रणाली के विकास के लिए महत्वपूर्ण कोशिका प्रकार में उत्थान के लिए एक सरल परख प्रदान करता है।
ट्रांसजेनिक जेब्राफिश के लिए प्रीस्क्रीन करना महत्वपूर्ण है जो न्यूरोमाट्स और आईएनएमसी में GFP को दृढ़ता से व्यक्त करता है। उज्ज्वल फ्लोरेसेंस के साथ लार्वा और प्राइमी-व्युत्पन्न न्यूरोमास्ट का लगभग भी अंतर लेजर एब्लेशन के लिए आदर्श उम्मीदवार हैं। यहां तक कि इन मछलियों में, कभी-कभी आईएनएमसी को मंद किया जाता है जो पहले बच सकते हैं। इन कोशिकाओं को लेजर ablation के बाद पीछे रह सकते हैं, INMCs के बीच एक सच्चे अंतर के गठन को रोकने । डिजिटल लाभ को प्री-एब्लेशन इमेजिंग के दौरान इन मंद कोशिकाओं को प्रकट करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए ताकि उन्हें 405 एनएम लेजर (चरण 8.2) के साथ भी लक्षित किया जा सके।
इसी तरह, लेजर लक्ष्यीकरण कभी-कभी पूरी तरह से एक कोशिका को नष्ट नहीं करेगा; बल्कि, यह फ्लोरेसेंस को ब्लीच करेगा, जिसके परिणामस्वरूप वास्तविक अंतर पैदा करने में विफलता होगी। इन कोशिकाओं को आम तौर पर टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी के दौरान फ्लोरेसेंस में वृद्धि होगी। टी-पीएमटी इमेजिंग(चित्रा 2)के साथ-साथ पोस्ट-एब्लेशन इमेजिंग स्टेप में लाभ समायोजन यह सुनिश्चित करने में मदद करता है कि लक्षित सभी कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से हटा दिया गया है। यह अक्सर दो या तीन व्यक्तिगत सेल ablations की आवश्यकता के लिए INMC स्ट्रिंग में एक अंतर का उत्पादन । सेल डेथ का पता ब्लीबिंग या लक्षित कोशिकाओं में दानेदार उपस्थिति से लगाया जा सकता है; हालांकि, लेजर लक्ष्यीकरण के बाद इसके लिए एक संक्षिप्त प्रतीक्षा अवधि की आवश्यकता हो सकती है (और कुछ मामलों में, स्पष्ट एपोप्टोटिक या परिगलित आंकड़े कुछ ही समय बाद देखे जाते हैं)।
इस प्रक्रिया की एक सीमा यह है कि लेजर स्थितियों को अनुकूलित करने से पहले कई प्रयोगात्मक परीक्षणों की आवश्यकता हो सकती है और आईएमसी पुनर्जनन सफल होता है। लेजर शक्ति और लेजर के कुल निवास समय प्रत्येक विभिन्न नमूनों के लिए मामूली समायोजन की आवश्यकता हो सकती है। यह पाया गया है कि अत्यधिक लेजर आवेदन पार्श्व लाइन की क्षमता को खुद की मरम्मत करने के लिए ख़राब कर सकते हैं। इसमें लेजर विकिरण के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं के ओवरएक्सपोजर दोनों शामिल हैं, संभवतः आसपास के ऊतकों को अतिरिक्त क्षति पहुंचाते हैं, साथ ही 2) स्ट्रिंग में बहुत अधिक कोशिकाओं का एब्लेशन, जिससे एक बड़ा अंतर होता है। उपयोगकर्ताओं को उनके विनाश को सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त रूप से विकिरण कोशिकाओं के बीच संतुलन प्राप्त करना चाहिए और कोशिकाओं को अधिक उजागर नहीं करना चाहिए, जो पुनर्जनन को धीमा या रोक सकता है। उपयुक्त सेटिंग्स के साथ, यह पाया गया है कि आईएनएमसी को पीछे की पार्श्व रेखा तंत्रिका को दिखाई देने वाली क्षति के बिना हटाया जा सकता है, यह दर्शाता है किविद्युतीकरण 11के विपरीत इस प्रोटोकॉल के साथ संपाश्र्वक क्षति को कम किया जाता है। किसी भी समय नए न्यूरोमास्ते नहीं थे, संभवतः क्योंकि पार्श्व रेखा तंत्रिका बरकरार रहती है और अंतर्निहित ग्लियल कोशिकाएं बनी रहती हैं और आईएनएमसी6,7,8, 11के प्रसार कोरोकतीहैं।
यह प्रदर्शित किया जाता है कि कॉन्फोकल लेजर एब्लेशन की इस विधि को अन्य सेल प्रकारों पर भी लागू किया जा सकता है, विशेष रूप से संवेदी बाल कोशिकाओं(चित्रा 4)सहित जानवर के भीतर स्थित उन सतही रूप से में। इसी तरह के प्रोटोकॉल का उपयोग त्वचा कोशिकाओं को अक्षीय पुनर्जनन अध्ययनों के लिए घाव की मरम्मत या न्यूरॉन्स की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि पहले13वर्णित है। यह अनुमान है कि इस तकनीक प्रयोगशालाओं कि एक confocal माइक्रोस्कोप के अधिकारी लेकिन लेजर ablation के लिए कोई अंय विशेष उपकरण के अधिकारी के प्रयोगात्मक प्रदर्शनों की सूची के लिए एक उपयोगी इसके अतिरिक्त बन जाएगा ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम NIH R15 अनुदान 1R15DC015352-01A1 और पेस विश्वविद्यालय आंतरिक वित्तपोषण स्रोतों द्वारा वित्त पोषित किया गया था । मछली लाइनें व्लादिमीर कोरज़14,केटी किंट15,16,और ए जेम्स हडस्पेथ की प्रयोगशाला के सौजन्य से थीं। हम इन प्रयोगों पर प्रतिक्रिया के लिए ए जेम्स हडस्पेथ और उनके समूह के सदस्यों और उनके समर्थन के लिए पेस यूनिवर्सिटी के सहयोगियों को धन्यवाद देना चाहते हैं । RStudio में रसद प्रतिगमन विश्लेषण विशेष रूप से हमारे सहयोगी मैथ्यू Aiello-Lammens द्वारा सहायता प्राप्त की थी ।
12-well PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Sciences | 63425-05 | |
15 mM Tricaine stock solution | Sigma | E10521 | 15 mM Tricaine in reverse osmosis water |
1X E3 + 600 µM Tricaine | Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media | ||
1X E3 media | Dilute 60X E3 media to 1X in reverse osmosis water (16.7 ml/L) | ||
60 X E3 media | All components purchased from Sigma-Aldrich | 34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water | |
Bx60 Compound microscope with mercury arc lamp fluorescence | Olympus | ||
LSM 700 confocal microscope equipped with 405 nm, 488 nm, and 555 or 561 nm lasers | Carl Zeiss Microscopy, LLC | A 5 mW 405 nm laser was used for ablation; Ablations and imaging were performed through a 63x Plan-Apochromat objective with an NA of 1.40 | |
FIJI/ImageJ Image processing software | Multiple contributors | Downloadable at https://fiji.sc/ | |
Dissecting needle modified into hair knife | Fisher Scientific | 19010 | An eyelash was glued onto the end of a wood-handled dissecting needle |
Microsoft Excel software | Microsoft Corp. | Google sheets is a no-cost alternative to Microsoft Excel | |
Glass bottom 35 mm dishes with no. 1.5 coverslip, 20 mm window | Mattek Corporation | P35G-1.5-20-C | 35 mm petri dish, 20 mm glass window |
Immersol 518F Immersion Oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
Low Gelling Agarose | Sigma Life Science | A9414-256 | |
Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert | Millipore Sigma | CLS3479-48EA | |
Rstudio software | Rstudio PBC | Downloadable at https://rstudio.com/ | |
SMX-168-BL Stereo microscope | Motic | ||
Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
ZEN software | Carl Zeiss Microscopy, LLC |