Laser ablation er en bredt anvendelig teknologi til at studere regenerering i biologiske systemer. Den præsenterede protokol beskriver brugen af et standard laserscanningskonfokalt mikroskop til laserablation og efterfølgende time-lapse-billeddannelse af regenererende interneuromastceller i zebrafisk laterallinjen.
Hårceller er mechanosensoriske celler, der mægle følelsen af hørelse. Disse celler regenereres ikke efter skader hos mennesker, men de genopfyldes naturligt i ikke-pattedyrhvirveldyr som zebrafisk. Zebrafisk lateral linje system er en nyttig model til at karakterisere sensorisk hår celle regenerering. Den laterale linje består af hårcelleholdige organer kaldet neuromaser, som er forbundet sammen af en række interneuromast celler (INMCs). INMCS fungerer som stamcelle, der giver anledning til nye neuromaste under udvikling. INMCs kan reparere huller i den laterale linje system skabt af celledød. En metode er beskrevet her for selektiv INMC ablation ved hjælp af en konventionel laser-scanning konfokal mikroskop og transgene fisk, der udtrykker grønne fluorescerende protein i INMCs. Time-lapse mikroskopi bruges derefter til at overvåge INMC regenerering og bestemme hastigheden af gap lukning. Dette repræsenterer en tilgængelig protokol for celle ablation, der ikke kræver specialiseret udstyr, såsom en høj-drevne pulserende ultraviolet laser. Ablation-protokollen kan tjene bredere interesser, da det kan være nyttigt for ablation af yderligere celletyper, der anvender et værktøjssæt, der allerede er tilgængeligt for mange brugere. Denne teknik vil yderligere gøre det muligt at karakterisering af INMC regenerering under forskellige forhold og fra forskellige genetiske baggrunde, som vil fremme forståelsen af sensorisk stamcelleregenerering.
Kernen i de fleste progressive høretab ligger ødelæggelsen af sensoriske hårceller, som transduce ydre auditive stimuli i nerveimpulser, der kan påvises af hjernen. Cochlear hår celle død forårsager permanent høretab, som voksne pattedyr mangler evnen til at regenerere disse celler efter skader. Omvendt kan ikke-pattedyr hvirveldyr såsom zebrafisk regenerere hårceller tabt til akustisk traume ellerototoksisk fornærmelse. Zebrafisk mechanosensory lateral linje er en enkel og let manipuleret organsystem, der kan bruges til at studere hårcelle regenerering1,2,3.
Den laterale linje består af små sensoriske pletter kaldet neuromastrere, som er forbundet under udviklingen af en række aflange celler kendt som interneuromast celler (INMCs). I betragtning af deres proliferative kapacitet som tilsyneladende stamceller, der giver anledning til nye hår celle-holdige organer, adfærd INPC’er er af stor interesse for samfundet4,5. Meget af forskningen vedrørende INMP’er har karakteriseret undertrykkelse af deres spredning af nærliggende Schwann celler, wrap omkring lateral linje nerve, sandsynligvis gennem en hæmmer af Wnt / β-catenin signalering. 6,7,8. Mens reguleringen af INMC spredning og differentiering i nye neuromaser er blevet godt beskrevet, de mekanismer, der regulerer INMC genvækst efter ablation er ikke blevet belyst. Denne protokol fungerer som et middel til at ablande individuelle INMCs og analysere deres efterfølgende regenerative adfærd.
En række metoder til at ødelægge hårceller, støtte celler, og hele neuromaturer er blevet offentliggjort, sammen med metoder til overvågning opsving. Kemisk ablation fungerer godt for hårceller, men doser af giftige kemikalier såsom CuSO4 skal øges betydeligt for at fjerne andre laterale linje celletyper9. Mens elektroablation under fluorescensmikroskopi er et effektivt og enkelt middel til at ødelægge INM’er for at studere regenerering, er det vanskeligt at målrette snævert og vil derfor sandsynligvis medføre betydelige følgeskader. Som et resultat, dette kan maskere aspekter af INMC-specifikke adfærd10,11. Laser ablation protokoller har været ansat, men de kræver brug af specialiseret udstyr ikke nødvendigvis til stede i den gennemsnitlige laboratorium eller billeddannelse facilitet (dvs. høj-drevne pulserende UV lasere12). Den metode, der er beskrevet her, kan udføres med enhver laser-scanning konfokal mikroskop udstyret med den fælles 405 nm laser, der normalt anvendes til billeddannelse DAPI og andre blå fluorophores. En fordel ved denne metode er, at konfokale billeddannelse kan udføres umiddelbart før og efter celleskader uden at engagere yderligere laser kontrolsystemer eller overføre til et andet mikroskop udstyret med en pulserende laser.
En lignende metode er blevet beskrevet for ablandende neuroner i zebrafisk rygmarven13. Den tidligere metode kræver dog et FRAP-modul til celleablation, hvilket ikke er et krav til denne protokol. I betragtning af de forskellige celletypers forskellige egenskaber (dvs. lysstyrken af transgenefluorescens, dybden i kroppen og celleformen) er det desuden sandsynligt, at der vil være behov for væsentlige ændringer afhængigt af den anvendte celletype. Protokollen beskrevet her er mere tilbøjelige til at være effektiv til mere overfladiske celler, som understøttes af en demonstration af sensorisk hårcelle ablation ved hjælp af samme metode. Også skitseret er en regenerering assay at vurdere INMC inddrivelse satser efter ablation, som ikke var en funktion af ovennævnte undersøgelse.
Den laserbaserede celleablationsprotokol, der er beskrevet heri, registrerer INMC’ernes regenerative kapacitet gennem optimering af laserforhold, præ- og post-ablation-billeddannelse og tidsforfaldmikroskopi. Disse elementer kommer sammen for omfattende skildre INMC genvækst og gap lukning i sin helhed. Mens denne protokol bruges her til at ødelægge INMCs, det kan anvendes til andet arbejde, der kræver pålidelig og effektiv vurdering af cellulære ablation. Det er også en tilgængelig teknologi, da det kan udføres på enhver konfokal mikroskop udstyret med en 405 nm laser.
Protokollen beskriver en alsidig metode til lasercelle ablation, der kan udføres på enhver konfokal mikroskop udstyret med en næsten ultraviolet laser (405 nm bølgelængde). Denne protokol omhandler begrænsninger af tidligere anvendte metoder såsom elektroablation (som forårsager mere udbredteskader 11) og pulserende UV-laser ablation (som kræver yderligere specialiseret udstyr12). Præ- og post-ablation konfokal billeddannelse giver hurtig feedback om succes eksperimentet. Efterfølgende time-lapse mikroskopi tilbyder en simpel analyse for regenerering i en celletype kritisk for sensorisk systemudvikling.
Det er af afgørende betydning at prescreen for transgene zebrafisk, der udtrykker GFP stærkt i neuromaker og INMCs. Larver med lys fluorescens og ca. jævn afstand af primI-afledte neuromaser er ideelle kandidater til laser ablation. Selv i disse fisk, der er lejlighedsvis lysdæmper INMCs, der kan ved første undslippe afsløring. Disse celler kan forblive bagud efter laser ablation, forhindrer dannelsen af en sand kløft mellem INMCs. Den digitale gevinst bør justeres for at afsløre disse lysdæmperceller under præ-ablation billeddannelse, således at de også kan målrettes med 405 nm laser (trin 8.2).
Tilsvarende laser målretning undertiden vil ikke helt ødelægge en celle; Snarere vil det blege fluorescens, hvilket resulterer i en manglende skabe en reel kløft. Disse celler vil generelt stige i fluorescens under timelaps mikroskopi. Forstærkningsjustering i post-ablation-billeddannelsestrinnet sammen med T-PMT-billeddannelse (Figur 2) er med til at sikre, at alle de celler, der er målrettet, er blevet fjernet effektivt. Det kræver ofte to eller tre individuelle celleablationer for at producere et mellemrum i INMC-strengen. Celledød kan påvises ved blebbing eller et granuleret udseende i de målrettede celler; selv om dette kan kræve en kort ventetid efter laser målretning (og i nogle tilfælde, tilsyneladende apoptotiske eller nekrotiske tal er observeret kort tid derefter).
En begrænsning af denne procedure er, at det kan kræve flere eksperimentelle forsøg, før laser betingelser er optimeret og INMC regenerering er en succes. Lasereffekten og den samlede dvæletid for laseren kan hver især kræve en mindre justering for forskellige prøver. Det er blevet konstateret, at overdreven laser ansøgning kan forringe muligheden for den laterale linje til at reparere sig selv. Dette omfatter både 1) overeksponering af individuelle celler til laserbestråling, formentlig forårsager yderligere skade på omgivende væv, samt 2) ablation af for mange celler i strengen, hvilket fører til et større hul. Brugerne skal opnå en balance mellem tilstrækkeligt bestrålende celler til at sikre deres ødelæggelse og ikke overeksponere cellerne, hvilket kan bremse eller forhindre regenerering. Med de relevante indstillinger, er det blevet konstateret, at INMCs kan fjernes uden synlige skader på den bageste laterale linje nerve, hvilket indikerer, at følgeskader er minimeret med denne protokol i modsætning til elektroablation11. I ingen tilfælde var nye neuromastrere danner i hullet observeret, formentlig fordi den laterale linje nerve forbliver intakt og underliggende gliaceller forbliver og hæmmer spredningen af INMCs6,7,8,11.
Det påvises, at denne metode til konfokal laserablation også kan anvendes på andre celletyper, især i dem, der overfladisk befinder sig i dyret, herunder sensoriske hårceller (Figur 4). En lignende protokol kan anvendes til at ablate hudceller til at undersøge sår reparation eller neuroner for axonal regenerering undersøgelser, som tidligere beskrevet13. Det forventes, at denne teknik vil blive et nyttigt supplement til den eksperimentelle repertoire af laboratorier, der besidder en konfokal mikroskop, men ingen andre specialiserede udstyr til laser ablation.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af NIH R15 tilskud 1R15DC015352-01A1 og Pace University interne finansieringskilder. Fisk linjer var høflighed af Vladimir Korzh14, Katie Kindt15,16, og laboratoriet af A. James Hudspeth. Vi vil gerne takke A. James Hudspeth og medlemmer af hans gruppe for feedback på disse eksperimenter, og kolleger på Pace University for deres støtte. Logistik regressionsanalyse i RStudio blev især hjulpet af vores kollega Matthew Aiello-Lammens.
12-well PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Sciences | 63425-05 | |
15 mM Tricaine stock solution | Sigma | E10521 | 15 mM Tricaine in reverse osmosis water |
1X E3 + 600 µM Tricaine | Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media | ||
1X E3 media | Dilute 60X E3 media to 1X in reverse osmosis water (16.7 ml/L) | ||
60 X E3 media | All components purchased from Sigma-Aldrich | 34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water | |
Bx60 Compound microscope with mercury arc lamp fluorescence | Olympus | ||
LSM 700 confocal microscope equipped with 405 nm, 488 nm, and 555 or 561 nm lasers | Carl Zeiss Microscopy, LLC | A 5 mW 405 nm laser was used for ablation; Ablations and imaging were performed through a 63x Plan-Apochromat objective with an NA of 1.40 | |
FIJI/ImageJ Image processing software | Multiple contributors | Downloadable at https://fiji.sc/ | |
Dissecting needle modified into hair knife | Fisher Scientific | 19010 | An eyelash was glued onto the end of a wood-handled dissecting needle |
Microsoft Excel software | Microsoft Corp. | Google sheets is a no-cost alternative to Microsoft Excel | |
Glass bottom 35 mm dishes with no. 1.5 coverslip, 20 mm window | Mattek Corporation | P35G-1.5-20-C | 35 mm petri dish, 20 mm glass window |
Immersol 518F Immersion Oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
Low Gelling Agarose | Sigma Life Science | A9414-256 | |
Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert | Millipore Sigma | CLS3479-48EA | |
Rstudio software | Rstudio PBC | Downloadable at https://rstudio.com/ | |
SMX-168-BL Stereo microscope | Motic | ||
Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
ZEN software | Carl Zeiss Microscopy, LLC |