ゼブラフィッシュ心臓機能を評価する高周波超音波心エコー検査

Summary

高周波心エコーを用いて成体ゼブラフィッシュの心臓形態と機能を評価するプロトコルについて述べている。この方法は、心拍数(HR)、心拍出量(CO)、分画領域変化(FAC)、放出分率(EF)、および血液流入および流出速度などの機能的パラメータの心臓およびその後の定量化を可視化することを可能にする。

Abstract

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、ヒトの心疾患を含む心血管研究において非常に人気のあるモデル生物となっており、その主な原因は、その胚の透明性、遺伝的な難解性、および迅速で高いスループットの研究へのアメニティに起因する。しかし、透明性の喪失は成人期の心臓機能分析を制限し、年齢に関連する心臓病のモデリングを複雑にする。このような制限を克服するために、ゼブラフィッシュにおける高周波超音波心エコー検査が実行可能な選択肢として浮上している。ここでは、高周波超音波を用いた非侵襲性心エコー検査により成体ゼブラフィッシュの心機能を評価するための詳細なプロトコルを提示する。この方法により、ゼブラフィッシュの心臓次元の可視化と分析、心拍数、脳卒中量、心拍出量、放出分率などの重要な機能パラメータの定量化が可能になります。この方法では、魚は麻酔を受けて水中に保たれ、処置後に回収することができる。高周波超音波は高価な技術ですが、同じイメージングプラットフォームは、異なるトランスデューサを適応させることによって、異なる種(例えば、マウスとゼブラフィッシュ)に使用することができます。ゼブラフィッシュ心エコー検査は、心臓のフェノタイピングのための堅牢な方法です, 疾患モデルの検証と特性評価に有用です, 特に遅発性疾患;薬物スクリーン;心臓の損傷、回復、および再生能力の研究。

Introduction

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、発達過程とヒト疾患の研究のための確立された脊椎動物モデル^である1.ゼブラフィッシュは、ヒト(70%)と高い遺伝的類似性を有し、遺伝的な難解性、高い胎児性、および胚発生中の光学的透明性を有し、心臓を含む器官および組織の直接的な視覚分析を可能にする。アトリウムと1つの心室を有するだけにもかかわらず、ゼブラフィッシュの心臓(図1)は哺乳類の四張心と生理学的に類似している。重要なのは、ゼブラフィッシュの心拍数、心電図形態、及び作用電位形状は、マウス種²よりもヒトのものに似ている。これらの特徴は、ゼブラフィッシュを心血管研究のための優れたモデルにし、^,心臓発達^3、4、4再生^5、および動脈硬化症、心筋症^、不整脈、先天性心疾患、アミロイド軽鎖心毒性1、4、6を⁶含む病理学^{的状態31,41、3、4}に関する主要な洞察^を提供してきた。⁴高速ビデオ顕微鏡^7,8を用いた直接ビデオ分析を通じて、胚期(受精後1日間)の間^に8心機能の評価が可能であった。しかし、ゼブラフィッシュは胚性期を超えて透明性を失い、正常な成熟した心臓および遅発性心状態の機能的評価を制限する。この制限を克服するために、心エコー検査は、成体ゼブラフィッシュ心拍^,機能^,,,99、10、11、12、13、14、15^,15を評価する高解像度、リアルタイム、非侵襲的イメージング代替手段としてうまく採用されている^,10。^11121314

ゼブラフィッシュでは、心臓は心室に後ろ側に位置するアトリウムを持つエラの直ちに後部の胸腔に腹腔に位置する。心房は静脈内の血液を静脈内静脈から採取し、心室に移し、そこでさらに球根動脈に送り込まれる(図1)。ここでは、30μmの解像度でBモードイメージングのための50MHzの中心周波数を有する線形アレイ超音波プローブを用いた非侵襲的心エコー検査により、成人ゼブラフィッシュの心機能を評価する生理学的、水中のプロトコルについて述べた。超音波は簡単に水を通過することができるので、魚と水中の走査プローブの間に近接保つことは、超音波ゲルを必要としない心臓検出のための十分な接触面を提供し、全体的に魚にとってストレスが少ない。代替ゼブラフィッシュ心エコーシステムは、いくつかの著者によって報告されました^99,12,,13,ここでは、動物の高周波超音波に適用される一般的かつ最も一般的に使用されるセットアップを提示します.

この方法により、成体ゼブラフィッシュ心臓の高解像度イメージング、心臓構造のトレース、ドップラー血流測定からのピーク速度の定量が可能になります。我々は、駆出率(EF)、分面積変化(FAC)、心室血流および流出速度、心拍数(HR)、心拍出量(CO)などの重要な収縮期および拡張期のパラメータを生体内で確実に定量化することを示す。病理状態をより正確に評価できるように、正常な健康な成体ゼブラフィッシュ心臓機能および次元パラメータの信頼できる範囲の確立に貢献する。全体として、ゼブラフィッシュの心機能を評価するための堅牢な方法を提供し、ゼブラフィッシュ心疾患モデル^66、16、16心臓損傷および回復^10、13、および再生^11、12の確立および検証に¹¹非常に有用であることが証明されており^、12潜在的な薬物を評価するためにさらに使用することができる。¹³

Protocol

ゼブラフィッシュに関するすべての手続きは、当社の制度的動物管理および使用委員会によって承認され、USDA動物福祉法に準拠しています。 1. 実験的なセットアップ 画像取得用プラットフォームの設定 小さいはさみやメスを使用すると、スキャン中に魚を保持するために12時の位置でスポンジの切開を行います。スポンジをガラス容器に入?…

Representative Results

記載されたプロトコルは、ヒトおよび動物の心エコー検査に用いられる技術に類似した、重要な心次元および機能的パラメータの測定を可能にする。Bモード画像は、収縮期および拡張期(図5)における心室内壁の追跡およびチャンバーおよび壁寸法などの次元データの取得、心拍数、脳卒中量、心拍出量などの機能データ、ならびに心室収縮率な…

Discussion

我々は、成体ゼブラフィッシュにおける心エコー画像と心機能評価の体系的な方法を説明する。心エコー検査は、生きた成魚の心臓イメージングおよび機能分析のための唯一の非侵襲的かつ最も堅牢な方法であり、ゼブラフィッシュ心血管研究でますます人気が高まっています。必要な時間は短く、ハイスループットと縦方向の研究が可能です。しかし、採用された方法論とデータ分析には?…

Materials

Double sided tape
Fish net
Glass container – 100 inch high
High frequency transducer	Fujifilm/VisualSonics	MX700	Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm
Plastic teaspoon
Scalpel or scissors
Small fish tanks
Sponge (kitchen sponge)
Transfer pipets (graduated 3 mL)	Samco Scientific	212
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	A5040
Vevo 3100 Imaging system and imaging station	Fujifilm/VisualSonics
Vevo LAB sofware v 1.7.1	Fujifilm/VisualSonics