Ecocardiografía por ultrasonido de alta frecuencia para evaluar la función cardíaca del pez cebra

Summary

Describimos un protocolo para evaluar la morfología del corazón y la función en el pez cebra adulto utilizando ecocardiografía de alta frecuencia. El método permite la visualización del corazón y la posterior cuantificación de parámetros funcionales, como la frecuencia cardíaca (HR), la salida cardíaca (CO), el cambio de área fraccionaria (FAC), la fracción de eyección (EF) y las velocidades de entrada y salida de la sangre.

Abstract

El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un organismo modelo muy popular en la investigación cardiovascular, incluyendo enfermedades cardíacas humanas, en gran parte debido a su transparencia embrionaria, traibilidad genética, y la amenidad a estudios rápidos y de alto rendimiento. Sin embargo, la pérdida de transparencia limita el análisis de la función cardíaca en la etapa adulta, lo que complica el modelado de afecciones cardíacas relacionadas con la edad. Para superar estas limitaciones, la ecocardiografía ecografio de alta frecuencia en el pez cebra está emergiendo como una opción viable. Aquí, presentamos un protocolo detallado para evaluar la función cardíaca en peces cebra adultos mediante ecocardiografía no invasiva mediante ultrasonido de alta frecuencia. El método permite la visualización y análisis de la dimensión cardíaca del pez cebra y la cuantificación de parámetros funcionales importantes, incluyendo la frecuencia cardíaca, el volumen del accidente cerebrovascular, la salida cardíaca y la fracción de eyección. En este método, los peces son anestesiados y mantenidos bajo el agua y pueden ser recuperados después del procedimiento. Aunque el ultrasonido de alta frecuencia es una tecnología costosa, la misma plataforma de imágenes se puede utilizar para diferentes especies (por ejemplo, murino y pez cebra) mediante la adaptación de diferentes transductores. La ecocardiografía de pez cebra es un método robusto para el fenotipado cardíaco, útil en la validación y caracterización de modelos de enfermedades, especialmente enfermedades de aparición tardía; pruebas de drogas; y estudios de lesiones cardíacas, recuperación y capacidad regenerativa.

Introduction

El pez cebra (Danio rerio) es un modelo de vertebrado bien establecido para estudios de procesos de desarrollo y enfermedades humanas¹. Los peces cebra tienen una alta similitud genética con los seres humanos (70%), la traibilidad genética, la alta fecundidad y la transparencia óptica durante el desarrollo embrionario, lo que permite el análisis visual directo de órganos y tejidos, incluido el corazón. A pesar de tener una sola aurícula y un ventrículo, el corazón del pez cebra(Figura 1)es fisiológicamente similar a los corazones de cuatro cámaras de los mamíferos. Es importante destacar que la frecuencia cardíaca del pez cebra, la morfología del electrocardiograma y la forma potencial de acción se asemejan más a las de los humanos más que a las especies de murinos^2. Estas características han hecho del pez cebra un excelente modelo para la investigación cardiovascular y han proporcionado información importante sobre el desarrollo cardíaco^3,4, regeneración⁵, y condiciones patológicas^1,3,4, incluyendo arteriosclerosis, cardiomiopatías, arritmias, enfermedades cardíacas congénitas, y cardiotoxicidad de la cadena de luz amiloide^1,4,6. La evaluación de la función cardíaca ha sido posible durante la etapa embrionaria (1 días después de la fertilización) a través del análisis de vídeo directo utilizando microscopía de vídeo de alta velocidad^7,,8. Sin embargo, el pez cebra pierde su transparencia más allá de la etapa embrionaria, limitando las evaluaciones funcionales de los corazones maduros normales y las condiciones cardíacas de aparición tardía. Para superar esta limitación, la ecocardiografía se ha empleado con éxito como una alternativa de imagen no invasiva, en tiempo real y de alta resolución para evaluar la función cardíaca de pez cebra adulto^{9,10,11,12,13,14,15}.

En el pez cebra, el corazón se encuentra ventralmente en la cavidad torácica inmediatamente posterior a las branquias con la aurícula situada dorsal al ventrículo. La aurícula recoge sangre venosa del venoso sinusal y la transfiere al ventrículo donde se bombea aún más al bulbo arterioso(Figura 1). Aquí, describimos un protocolo fisiológico, submarino, para evaluar la función cardíaca en el pez cebra adulto por ecocardiografía no invasiva utilizando una sonda de ultrasonido de matriz lineal con una frecuencia central de 50 MHz para imágenes en modo B a una resolución de 30 m. Dado que las ondas de ultrasonido pueden viajar fácilmente a través del agua, mantener una proximidad cercana entre el pez y la sonda de exploración bajo el agua proporciona suficiente superficie de contacto para la detección del corazón sin necesidad de gel de ultrasonido y en general es menos estresante para los peces. Aunque varios autores^99,12,,13,aquí presentamos la configuración general y más utilizada que se aplica al ultrasonido de alta frecuencia en animales.

El método permite imágenes de alta resolución del corazón adulto del pez cebra, el rastreo de estructuras cardíacas y la cuantificación de las velocidades máximas de las mediciones del flujo sanguíneo de Doppler. Mostramos una cuantificación in vivo fiable de parámetros sistólicos y diastólicos importantes, como la fracción de eyección (EF), el cambio de área fraccionaria (FAC), las velocidades de entrada y salida de sangre ventricular, la frecuencia cardíaca (HR) y la salida cardíaca (CO). Contribuimos a establecer una gama fiable de parámetros funcionales y dimensionales cardíacos normales de pez cebra adulto sano para permitir una evaluación más precisa de los estados patológicos. En general, proporcionamos un método robusto para evaluar la función cardíaca en el pez cebra, que ha demostrado ser extremadamente útil en el establecimiento y validación de los modelos de enfermedades del corazón del pez cebra^6,16, lesión cardíaca y recuperación^10,13,y regeneración^11,12, y se puede utilizar más para evaluar fármacos potenciales.

Protocol

Todos los procedimientos relacionados con el pez cebra fueron aprobados por nuestro Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y cumplen con la Ley de Bienestar Animal del USDA. 1. Configuración experimental Configuración de la plataforma para la adquisición de imágenes Usando tijeras pequeñas o un bisturí hacer una incisión en una esponja en la posición de las 12 en punto para sostener el pez durante el escaneo. Coloque la esponja en un re…

Representative Results

El protocolo descrito permite la medición de parámetros dimensionales y funcionales cardíacos importantes, análogos a la técnica utilizada en la ecocardiografía humana y animal. Las imágenes en modo B permiten rastrear la pared interna ventricular en la sístole y la diástole(Figura 5) y obtener datos dimensionales, como dimensiones de cámara y pared, y datos funcionales, como la frecuencia cardíaca, el volumen de carrera y la salida cardíaca, así…

Discussion

Describimos un método sistemático para la toma de imágenes ecocardiográficas y la evaluación de la función cardíaca en peces cebra adultos. La ecocardiografía es el único método no invasivo y más robusto disponible para las imágenes cardíacas y el análisis funcional de peces adultos vivos, y se está volviendo cada vez más popular en la investigación cardiovascular del pez cebra. La cantidad de tiempo necesario es corta y permite estudios longitudinales y de alto rendimiento. Sin embargo, hay una variaci?…

Materials

Double sided tape
Fish net
Glass container – 100 inch high
High frequency transducer	Fujifilm/VisualSonics	MX700	Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm
Plastic teaspoon
Scalpel or scissors
Small fish tanks
Sponge (kitchen sponge)
Transfer pipets (graduated 3 mL)	Samco Scientific	212
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	A5040
Vevo 3100 Imaging system and imaging station	Fujifilm/VisualSonics
Vevo LAB sofware v 1.7.1	Fujifilm/VisualSonics