Determinação da eficiência do inibidor químico contra o crescimento intracelular toxoplasma Gondii usando um ensaio de crescimento baseado em luciferase
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para avaliar a eficácia da inibição de compostos químicos contra o crescimento intracelular in vitro de Toxoplasma gondii usando um ensaio de crescimento à base de luciferase. A técnica é usada para confirmar a especificidade da inibição pela exclusão genética do gene alvo correspondente. A inibição do LHVS contra a protease TgCPL é avaliada como um exemplo.
Abstract
Toxoplasma gondii é um patógeno protozoário que afeta amplamente a população humana. Os antibióticos atuais utilizados no tratamento da toxoplasmose clínica são limitados. Além disso, apresentam efeitos colaterais adversos em certos grupos de pessoas. Portanto, a descoberta de novas terapêuticas para toxoplasmose clínica é imperativa. O primeiro passo do novo desenvolvimento de antibióticos é identificar compostos químicos que ausitem alta eficácia na inibição do crescimento de parasitas usando uma estratégia de triagem de alto desempenho. Como um patógeno intracelular obrigatório, o Toxoplasma só pode se replicar dentro das células hospedeiras, o que proíbe o uso de medidas de absorvância óptica como um indicador rápido de crescimento. Apresentado aqui é um protocolo detalhado para um ensaio de crescimento baseado em luciferase. Como exemplo, este método é usado para calcular o tempo de duplicação de parasitas toxoplasma do tipo selvagem e medir a eficácia do crescimento intracelular de morfolinurea-leucil-leucyl-vinil sulfone (LHVS, um composto de protease cisteína) em relação à inibição do crescimento intracelular parasitário. Também é descrito um protocolo de exclusão genética baseado em CRISPR-Cas9 no Toxoplasma usando regiões homólogas de 50 bp para recombinação dependente de homologia (HDR). Ao quantificar as eficácias de inibição do LHVS em tipos selvagens e tgCPL (Toxoplasma cathepsin L-like protease)-deficientes, é mostrado que o LHVS inibe o crescimento de parasitas do tipo selvagem de forma mais eficiente do que o crescimento de Δcpl, sugerindo que o TgCPL é um alvo ao que o LHVS se liga no Toxoplasma. A alta sensibilidade e o fácil funcionamento deste ensaio de crescimento à base de luciferase tornam-no adequado para monitorar a proliferação do Toxoplasma e avaliar a eficácia da droga de forma de alta produtividade.
Introduction
Toxoplasma gondii é um parasita intracelular altamente bem sucedido que infecta aproximadamente um terço da população humana. Sua alta taxa de transmissão é predominantemente devido às suas diversas rotas de transmissão, incluindo consumo de carne mal cozida, exposição a reservatórios de mamíferos e transmissão congênita durante o nascimento. T. gondii causa principalmente infecções oportunistas que podem levar à morbidade e mortalidade graves em indivíduos imunocomprometidos1,2,3,4,5,6. Os antibióticos atualmente utilizados no tratamento da toxoplasmose aguda são particularmente ineficientes no tratamento de infecções congênitas e latentes e causam reações severas em alguns indivíduos3,7,8. Assim, existe uma necessidade urgente de identificar novas terapêuticas. Entender as diferenças nos processos subcelulares dentro do Toxoplasma e seu hospedeiro ajudará a identificar potenciais alvos de drogas. Portanto, técnicas eficientes e convenientes de manipulação do genoma são necessárias para estudar os papéis dos genes individuais dentro do Toxoplasma. Além disso, o Toxoplasma pertence ao filo Apicomplexa, que inclui vários outros patógenos humanos significativos, como Plasmodium spp. e Cryptosporidium spp. Assim, o Toxoplasma pode ser usado como um organismo modelo para ajudar a estudar a biologia básica em outros parasitas apicomplexos.
Para identificar novos antibióticos contra patógenos microbianos, a triagem de alto desempenho de uma biblioteca de compostos químicos é inicialmente realizada para determinar sua eficácia na repressão do crescimento microbiano. Até agora, vários ensaios de crescimento baseados em microplacas foram desenvolvidos para medir o crescimento intracelular de T. gondii (ou seja, quantificação radioativa baseadaem 3 H-uracil9, detecção quantitativa de parasitas baseados em ELISA usando anticorpos t. gondii-específicos10,11, medição baseada em proteína de repórter usando β-galactosidase ou YFP expressante toxoplasma cepas12,13, e um ensaio de imagem de alto conteúdo recentemente desenvolvido14).
Todas essas estratégias individuais têm vantagens únicas; no entanto, certas limitações também restringem suas aplicações. Por exemplo, uma vez que o Toxoplasma só pode se replicar dentro de células animais nucleadas, a autofluorescência e a ligação não específica de anticorpos anti-T.gondii às células hospedeiras causam interferência em medidas baseadas em fluorescência. Além disso, o uso de isótopos radioativos requer conformidade especial de segurança e potenciais problemas de segurança. Alguns desses ensaios são mais adequados para avaliar o crescimento em um único ponto de tempo, em vez de um monitoramento contínuo do crescimento.
Apresentado aqui é um protocolo baseado em luciferase para a quantificação do crescimento intracelular do Toxoplasma. Em um estudo anterior, o gene da luciferase de NanoLuc foi clonado sob o promotor da tubbulina Toxoplasma, e esta construção de expressão de luciferase foi transfeccionada em parasitas do tipo selvagem (RHΔku80Δhxg) para criar um RHΔku80Δhxg::NLuc strain (referido como RHΔku80::NLuc a seguir)15. Essa cepa serviu como a cepa parental para determinação do crescimento intracelular e exclusão genética neste estudo. Utilizando o RHΔku80:: A cepade NLuc, o crescimento de parasitas em fibroblastos de prepúcio humano (HFFs) foi monitorado durante um período de 96 h pós-infecção para calcular o tempo de duplicação do parasita.
Além disso, a eficácia da inibição do LHVS contra o crescimento de parasitas pode ser determinada plotando as taxas de crescimento do Toxoplasma contra concentrações de LHVS seriais para identificar o valor ic50. A literatura anterior relatou que o TgCPL é um dos principais alvos de LHVS em parasitas e que o tratamento com LHVS diminui o desenvolvimento de infecções agudas e crônicas de Toxoplasma 16,,17,18,19. Além disso, RHΔku80::NLuc foi usado como a cepa parental para modificação do genoma para gerar uma cepa tgCPL-deficiente(RHΔku80Δcpl::NLuc), e a inibição do LHVS foi medida contra este mutante. Ao observar uma mudança de valores de IC50 para LHVS nos parasitas deficientes tgCPLem comparação com a cepa WT, foi validado que o TgCPL é alvo do LHVS in vivo.
Neste protocolo, RHΔku80::NLuc é usado como a cepa parental, que não tem um caminho de junção final não homólogo eficiente (NHEJ), facilitando assim a recombinação dupla mente dependente da homologia (HDR)20,21. Além disso, as regiões homólogas de 50 bp são flanqueadas em ambas as extremidades de um de resistência a drogas por PCR. O produto PCR serve como um modelo de reparo para remover todo o lócus genético via HDR usando ferramentas de edição de genoma baseadas em CRISPR-Cas9. Tais regiões homólogos curtas podem ser facilmente incorporadas em primers, fornecendo uma estratégia conveniente para a produção do modelo de reparo. Este protocolo pode ser modificado para realizar a exclusão genética universal e a marcação endógena genética.
Por exemplo, em nossa publicação mais recente, três genes protease, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma cathepsin B-like protease) e TgSUB1 (Toxoplasma subtilisin-like protease 1), foram geneticamente ablados em TgCRT (Toxoplasma cloroquina-resistência transporte)-deficientes parasitas usando este método15. Além disso, tgAMN (um aminopeptidase putativo N [TgAMN, TGGT1_221310]) foi marcado endógenamente15. O laboratório de Lourido também relatou o uso de regiões homólogos curtas na faixa de 40-43 bp para a introdução de mutação genética direcionada ao local e marcação de genes endógenos no genoma de Toxoplasma usando um método semelhante22. Essas modificações de genoma bem sucedidas sugerem que uma região homóloga de 40-50 bp é suficiente para uma recombinação eficiente de DNA na cepa tgKU80-deficiente, o que simplifica muito a manipulação do genoma em Toxoplasma gondii.
Protocol
Representative Results
Discussion
++Este protocolo descreve um protocolo baseado em luciferase para avaliar o crescimento do Toxoplasma intracelular e avaliar a eficácia da inibição de compostos químicos contra o crescimento de parasitas. Comparado com as estratégias existentes disponíveis para medir o crescimento do Toxoplasma intracelular, este método apresenta alta sensibilidade e especificidade. Enquanto monitora o crescimento de parasitas, recomenda-se um ensaio simulado em uma microplaca clara de 96 poços para confirmar qu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer aos Drs. Sibley e Carruthers por compartilharem os anticorpos pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT e anti-TgCPL e TgActin. Este trabalho foi apoiado pelo fundo Clemson Startup (para Z.D.), Knights Templar Eye Foundation Pediatric Oftalmology Career-Starter Research Grant (para Z.D.), uma bolsa piloto de uma bolsa NIH COBRE P20GM109094 (para Z.D.), e NIH R01AI143707 (para Z.D.). Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou elaboração do manuscrito.
Materials
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
Referências
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