Determinación de la eficiencia de los inhibidores químicos contra el crecimiento de toxoplasma intracelular Gondii mediante un ensayo de crecimiento basado en Luciferase
Summary
Aquí se presenta un protocolo para evaluar la eficacia de la inhibición de los compuestos químicos contra el crecimiento intracelular in vitro de Toxoplasma gondii utilizando un ensayo de crecimiento basado en luciferasa. La técnica se utiliza para confirmar la especificidad de la inhibición mediante la eliminación genética del gen diana correspondiente. La inhibición de LHVS contra la proteasa TgCPL se evalúa como ejemplo.
Abstract
El toxoplasma gondii es un patógeno protozoario que afecta ampliamente a la población humana. Los antibióticos actuales utilizados para tratar la toxoplasmosis clínica son limitados. Además, exhiben efectos secundarios adversos en ciertos grupos de personas. Por lo tanto, el descubrimiento de nuevas terapias para la toxoplasmosis clínica es imperativo. El primer paso del desarrollo de antibióticos novedosos es identificar compuestos químicos que muestren una alta eficacia en la inhibición del crecimiento del parásito utilizando una estrategia de cribado de alto rendimiento. Como patógeno intracelular obligatorio, el toxoplasma sólo puede replicarse dentro de las células huésped, lo que prohíbe el uso de mediciones de absorbancia óptica como un indicador rápido de crecimiento. Aquí se presenta un protocolo detallado para un ensayo de crecimiento basado en luciferasa. Como ejemplo, este método se utiliza para calcular el tiempo de duplicación de los parásitos toxoplasma de tipo salvaje y medir la eficacia de morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl (LHVS, un compuesto de cisteína proteasa-targeting) con respecto a la inhibición del crecimiento intracelular del parásito. También se describe un protocolo de eliminación de genes basado en CRISPR-Cas9 en Toxoplasma que utiliza regiones homólogas de 50 bp para la recombinación dependiente de la homología (HDR). Al cuantificar las eficacias de inhibición de LHVS en parásitos de tipo salvaje y TgCPL (Toxoplasma catepsina L-como proteasa) -parásitos deficientes), se muestra que LHVS inhibe el crecimiento de parásitos de tipo salvaje de manera más eficiente que el crecimiento de la écpl, lo que sugiere que TgCPL es un objetivo al que LHVS se une en Toxoplasma. La alta sensibilidad y fácil operación de este ensayo de crecimiento basado en luciferasa lo hacen adecuado para monitorear la proliferación de Toxoplasma y evaluar la eficacia de los fármacos de una manera de alto rendimiento.
Introduction
El toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado de gran éxito que infecta aproximadamente un tercio de la población humana. Su alta tasa de transmisión se debe principalmente a sus diversas vías de transmisión, incluyendo el consumo de carne poco cocida, la exposición a los reservorios de mamíferos y la transmisión congénita durante el nacimiento. T. gondii provoca principalmente infecciones oportunistas que pueden conducir a una morbilidad y mortalidad graves en individuos inmunocomprometidos1,2,3,4,5,6. Los antibióticos utilizados actualmente para el tratamiento de la toxoplasmosis aguda son particularmente ineficientes en el tratamiento de infecciones congénitas y latentes y causan reacciones graves en algunos individuos3,7,8. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de identificar nuevas terapias. Comprender las diferencias en los procesos subcelulares dentro de Toxoplasma y su huésped ayudará a identificar posibles objetivos farmacológicos. Por lo tanto, se requieren técnicas de manipulación del genoma eficientes y convenientes para estudiar las funciones de los genes individuales dentro de Toxoplasma. Además, Toxoplasma pertenece al phylum Apicomplexa, que incluye varios otros patógenos humanos significativos, como Plasmodium spp. y Cryptosporidium spp. Por lo tanto, toxoplasma se puede utilizar como un organismo modelo para ayudar a estudiar la biología básica en otros parásitos apicomplexanos.
Para identificar nuevos antibióticos contra patógenos microbianos, se realiza inicialmente un cribado de alto rendimiento de una biblioteca de compuestos químicos para determinar su eficacia en la represión del crecimiento microbiano. Hasta ahora, se han desarrollado varios ensayos de crecimiento basados en microplacas para medir el crecimiento intracelular de T. gondii (es decir, cuantificación radiactiva basada en la incorporación de 3H-uracil9, detección cuantitativa de parásitos basada en ELISA utilizando anticuerpos específicos de T. gondii10,11, medición basada en proteínas de reportero utilizando cepas de toxoplasma 12,,13y un ensayo de imágenes de alto contenido desarrollado recientemente14).
Todas estas estrategias individuales tienen ventajas únicas; sin embargo, ciertas limitaciones también restringen sus aplicaciones. Por ejemplo, dado que el toxoplasma sólo puede replicarse dentro de células animales nucleadas, la autofluorescencia y la unión no específica de anticuerpos anti-T.gondii a las células huésped causan interferencia en las mediciones basadas en fluorescencia. Además, el uso de isótopos radiactivos requiere un cumplimiento de seguridad especial y posibles problemas de seguridad. Algunos de estos ensayos son más adecuados para evaluar el crecimiento en un solo punto de tiempo en lugar de un monitoreo continuo del crecimiento.
Aquí se presenta un protocolo basado en la luciferasa para la cuantificación del crecimiento intracelular del toxoplasma. En un estudio anterior, el gen NanoLuc luciferase fue clonado bajo el promotor de la tubulina Toxoplasma, y esta construcción de expresión de luciferasa fue transfigurada en parásitos de tipo salvaje (cepa dehúmúxtas RHku80)para crear una cepa deRH-ku80-hxg::NLuc (denominada RHku80::NLuc en adelante)15. Esta cepa sirvió como la cepa parental para la determinación del crecimiento intracelular y la eliminación de genes en este estudio. Usando elRH ku80::Cepa NLuc, el crecimiento del parásito en fibroblastos de prepucio humano (HHF) fue monitoreado durante un período de 96 horas después de la infección para calcular el tiempo de duplicación del parásito.
Además, la eficacia de inhibición de LHVS contra el crecimiento de parásitos se puede determinar trazando las tasas de crecimiento de Toxoplasma contra las concentraciones seriales de LHVS para identificar el valor IC50. La literatura anterior ha informado de que TgCPL es un objetivo importante de LHVS en parásitos y que el tratamiento con LHVS disminuye el desarrollo de infecciones agudas y crónicas por toxoplasma 16,,17,18,19. Además, RHku80::NLuc se utilizó como la cepa parental para la modificación del genoma para generar una cepa deficiente de TgCPL(RHs ku80ácpl::NLuc), y la inhibición de LHVS se midió contra este mutante. Al observar un cambio ascendente de valores IC50 para LHVS en los parásitos con deficiencia de TgCPLen comparación con la cepa WT, se validó que TgCPL está dirigido por LHVS in vivo.
En este protocolo, RHku80::NLuc se utiliza como cepa parental, que carece de una vía de unión final no homóloga eficiente (NHEJ), facilitando así la recombinación dependiente de la homología de doble cruce (HDR)20,21. Además, las regiones homólogas de 50 bp están flanqueadas en ambos extremos de un casete de resistencia a fármacos por PCR. El producto PCR sirve como plantilla de reparación para eliminar todo el origen genético a través de HDR utilizando herramientas de edición del genoma basadas en CRISPR-Cas9. Estas regiones homolometales cortas se pueden incorporar fácilmente en las imprimaciones, proporcionando una estrategia conveniente para la producción de la plantilla de reparación. Este protocolo se puede modificar para realizar la eliminación universal de genes y el etiquetado genético endógeno.
Por ejemplo, en nuestra publicación más reciente, tres genes de proteasa, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma catethepsin A B-like protease), y TgSUB1 (Toxoplasma subtilisina-like protease 1), fueron genéticamente ablados en TgCRT (Toxoplasma chloroquine-resistance transporter) -parásitos deficientes utilizando este método15. Además, TgAMN (a putative aminopeptidase N [TgAMN, TGGT1_221310]) fue etiquetado endógenamente15. El laboratorio de Lourido también informó utilizando regiones homoólogas cortas en el rango de 40-43 bp para la introducción de la mutación genética dirigida por el sitio y el etiquetado genético endógeno en el genoma de Toxoplasma utilizando un método similar22. Estas modificaciones exitosas del genoma sugieren que una región homóloga de 40-50 bp es suficiente para una recombinación eficiente del ADN en la cepa deficiente de TgKU80,lo que simplifica en gran medida la manipulación del genoma en Toxoplasma gondii.
Protocol
Representative Results
Discussion
++Este protocolo describe un protocolo basado en la luciferasa para evaluar el crecimiento de Toxoplasma intracelular y evaluar la eficacia de inhibición de los compuestos químicos contra el crecimiento del parásito. En comparación con las estrategias existentes disponibles para medir el crecimiento de Toxoplasma intracelular, este método presenta alta sensibilidad y especificidad. Mientras se supervisa el crecimiento del parásito, se recomienda un ensayo simulado en una microplaca transparente de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean dar las gracias a los Doctores Sibley y Carruthers por compartir los anticuerpos pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT y anti-TgCPL y TgActin. Este trabajo fue apoyado por el fondo Clemson Startup (a Z.D.), Knights Templar Eye Foundation Pediatric Ophthalmology Career-Starter Research Grant (a Z.D.), una subvención piloto de una subvención NIH COBRE P20GM109094 (a Z.D.), y NIH R01AI143707 (a Z.D.). Los funderos no tenían ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
Referências
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