O transporte axonal é um mecanismo crucial para a saúde dos neurônios motores. Neste protocolo fornecemos um método detalhado para rastrear o transporte axonal de compartimentos ácidos e mitocôndrias em axônios de neurônios motores usando câmaras microfluidas.
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Artigo de método
Transporte Axonal de Organelas em Culturas de Neurônios Motores usando sistema de câmaras microfluidas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neurônios motores (MNs) são células altamente polarizadas com axônios muito longos. O transporte axonal é um mecanismo crucial para a saúde da MN, contribuindo para o crescimento neuronal, desenvolvimento e sobrevivência. Descrevemos um método detalhado para o uso de câmaras microfluidas (MFCs) para o rastreamento do transporte axonal de organelas fluorescentemente rotuladas em axônios MN. Este método é rápido, relativamente barato, e permite o monitoramento de pistas intracelulares no espaço e no tempo. Descrevemos um protocolo passo a passo para: 1) Fabricação de MFCs polidimetilsiloxano (PDMS); 2) Revestimento de explantas medulares ventral e cultura dissociada de MN em MFCs; 3) Rotulagem de mitocôndrias e compartimentos ácidos seguidos de imaginação confocal viva; 4) Análise manual e semiautomatizada do transporte axonal. Por último, demonstramos uma diferença no transporte de mitocôndrias e compartimentos ácidos da medula espinhal bcólmila HB9::GFP da medula espinhal explante axôns como prova da validade do sistema. Ao todo, este protocolo fornece uma ferramenta eficiente para estudar o transporte axonal de vários componentes axonais, bem como um manual simplificado para o uso de MFC para ajudar a descobrir possibilidades experimentais espaciais.
Introdução
As Esms são células altamente polarizadas com axônios longos, alcançando até um metro de comprimento em humanos adultos. Esse fenômeno cria um desafio crítico para a manutenção da conectividade e função MN. Consequentemente, as MNs dependem do transporte adequado de informações, organelas e materiais ao longo dos axônios do corpo celular para a sinapse e para trás. Vários componentes celulares, como proteínas, RNA e organelas são transportados regularmente através dos axônses. Mitocôndrias são organelas importantes que são rotineiramente transportadas em MNs. Mitocôndrias são essenciais para a atividade e função adequada das Ems, responsáveis pelo fornecimento de ATP,....
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Protocolo
O cuidado e tratamento dos animais neste protocolo foram realizados sob a supervisão e aprovação do Comitê de Ética Animal da Universidade de Tel Aviv.
1. Preparação do MFC
- Fundição PDMS em moldes primários (Figura 1)
- Comprar ou criar moldes primários (wafers) seguindo um protocolo detalhado9.
- Use ar pressurizado para remover qualquer tipo de sujeira da plataforma de wafer antes de seguir para a etapa de revestimento. A superfície dos wafers deve parecer lisa e clara.
- Encha um recipiente com 50 mL de nitrogênio líquido. Prepare uma seringa de 10 mL....
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Resultados
Seguindo o protocolo descrito, as explantas da medula espinhal do rato foram cultivadas em MFC (Figura 4A). Explantas foram cultivadas por 7 dias, quando os axônses se cruzaram totalmente para o compartimento distal. Os corantes vermelhos profundos mitotracker e lisotracker foram adicionados aos compartimentos distal e proximal, a fim de rotular as mitocôndrias e compartimentos ácidos(Figura 4C)........
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Discussão
Neste protocolo, descrevemos um sistema para rastrear o transporte axonal de mitocôndrias e compartimentos ácidos nos neurônios motores. Esta plataforma in vitro simplificada permite o controle, o monitoramento e a manipulação precisas de compartimentos neuronais subcelulares, permitindo a análise experimental das funções locais dos neurônios motores. Este protocolo pode ser útil para o estudo de doenças de MN, como a ELA, para focar na compreensão do mecanismo subjacente da disfunção do transporte axonal na doença
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Divulgações
Os autores não declaram conflito de interesses.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Israel science (ISF, 561/11) e do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC, 309377).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 35mm Fluodish - prato de fundo de vidro | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish - prato de fundo de vidro World | Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD câmera | Andor | ||
| ARA-C (Citosina β -D-arabinofuranosídeo) | Sigma-Aldrich | C1768 | estoque de 2mM em filtrado DDW |
| B-27 Suplemento (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Diluir para 10 µ g/mL em ddw filtrado com 0,01% BSA) |
| Punção de biópsia 1,25 mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | Para preparação de grande |
| MFC Punção de biópsia 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | Para preparação de pequeno MFC |
| Punção de biópsia 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | Para preparação de grande MFC |
| Bitplane Software Imaris - versão 8.4.1 | Albumina | ||
| (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% p/v em ddw |
| Clorotrimetilsilano | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Diluir para 10 µ g / mL em ddw filtrado com 0,01% BSA) |
| Gradiente de Densidade Médio - Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Desoxirribonuclease I (DNAse) do pâncreas bovino | Sigma-Aldrich | DN-25 | estoque 10mg / mL em neurobasal |
| Dow Corning Graxa de silicone de alto vácuo | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | Para preparação de molde epóxi |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | # 14200-067 | Diluir 1:10 em DDW |
| Pinça fina Dumont #55 0,05 &vezes; 0,02 mm | F.S.T | ||
| Endurecedor Epóxi | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | Para preparação de moldes epóxi |
| Resina Epóxi | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | Para preparação de moldes epóxi |
| Software FIJI | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Diluir para 10 µ g/mL em ddw filtrado com 0,01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP cepa de camundongos | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Diluir 1:10 em ddw com adição de 1% P/S e |
| filtro iQ software | Andor | ||
| Iris tesoura, curva, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Tesoura de íris, reta, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 | Medium Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Meio neurobasal | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti microscópio | Nikon | ||
| Penicilina-Estreptomicina (P/S) Solução | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poli-L-Ornitina (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Diluir 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 kit de elastômero de silicone | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Tripsina do pâncreas bovino | Sigma-Aldrich | T1426 | estoque 25 mg/mL em tesoura de |
| microdissecção de mola 1XPBS Vannas, lâmina de 3 mm | FST | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
Referências
- Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
- Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neu....
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Reimpressões e permissões
