Summary

Trasporto assonale di Organanelle nelle colture del motoneurone utilizzando il sistema di camere microfluidiche

Published: May 05, 2020
doi:

Summary

Il trasporto assonale è un meccanismo cruciale per la salute dei motoneuroni. In questo protocollo forniamo un metodo dettagliato per tracciare il trasporto assonale di compartimenti acidi e mitocondri negli assoni dei motoneuroni utilizzando camere microfluidiche.

Abstract

I motoneuroni (MN) sono cellule altamente polarizzate con assoni molto lunghi. Il trasporto assonale è un meccanismo cruciale per la salute di MN, contribuendo alla crescita neuronale, allo sviluppo e alla sopravvivenza. Descriviamo un metodo dettagliato per l’uso di camere microfluidiche (MFC) per il monitoraggio del trasporto assonale di organelli etichettati fluorescenti negli assoni MN. Questo metodo è rapido, relativamente poco costoso, e consente il monitoraggio di segnali intracellulari nello spazio e nel tempo. Descriviamo un protocollo passo dopo passo per: 1) Fabbricazione di MFC polidimetilsiloxane (PDMS); 2) placcatura degli esanti del midollo spinale ventrale e coltura dissociata MN nelle MFC; 3) Etichettatura dei mitocondri e dei compartimenti acidi seguita dall’immaginazione confocale viva; 4) Analisi manuale e semiautomatica del trasporto assonale. Infine, dimostriamo una differenza nel trasporto di mitocondri e compartimenti acidi di HB9::GFP del midollo spinale ventrale degli assoni explant come prova della validità del sistema. Complessivamente, questo protocollo fornisce uno strumento efficiente per studiare il trasporto assonale di vari componenti assonali, nonché un manuale semplificato per l’utilizzo di MFC per aiutare a scoprire le possibilità spaziali sperimentali.

Introduction

Le MN sono cellule altamente polarizzate con lunghi assoni, che raggiungono fino a un metro di lunghezza negli esseri umani adulti. Questo fenomeno crea una sfida critica per il mantenimento della connettività e della funzione MN. Di conseguenza, le MN dipendono da un corretto trasporto di informazioni, organelli e materiali lungo gli assoni dal loro corpo cellulare alla sinapsi e alla schiena. Vari componenti cellulari, come proteine, RNA e organelli, vengono trasportati regolarmente attraverso gli assoni. I mitocondri sono organelli importanti che vengono regolarmente trasportati in MN. I mitocondri sono essenziali per la corretta attività e funzione delle MN, responsabili della fornitura ATP, del buffering del calcio e dei processi di segnalazione1,2. Il trasporto assonale dei mitocondri è un processo ben studiato3,4. È interessante notare che, difetti nel trasporto mitocondriale sono stati segnalati per essere coinvolti in diverse malattie neurodegenerative e in particolare nelle malattie MN5. I compartimenti acidi servono come un altro esempio per gli organelli intrinseci che si muovono lungo gli assoni MN. I compartimenti acidi includono lisosomi, endosomi, apparati trans-Golgi e alcune vescicle secretory6. I difetti nel trasporto assonale di compartimenti acidi sono stati riscontrati in diverse malattie neurodegenerative e7, e recenti documenti sottolineano la loro importanza nelle malattie MN8.

Per studiare in modo efficiente il trasporto assonale, le camere microfluidiche che separano i compartimenti somatici ed assonali sono spesso utilizzate9,10. I due vantaggi significativi del sistema microfluidico, e la compartimentazione e l’isolamento degli assoni, lo rendono ideale per lo studio dei processi subcellulari11. La separazione spaziale tra i corpi cellulari neuronali e gli assoni può essere utilizzata per manipolare gli ambienti extracellulari di diversi compartimenti neuronali (ad esempio, assoni contro soma). Biochimica, crescita/degenerazione neuronale e immunofluorescenza attraggono tutti i benefici di questa piattaforma. Le MFC possono anche aiutare a studiare la comunicazione tra cellule coculcolando neuroni con altri tipi di cellule, come i muscoli scheletrici12,13,14.

Qui, descriviamo un protocollo semplice ma preciso per il monitoraggio dei mitocondri e del trasporto dei compartimenti acidi nei motoneuroni. Mostriamo inoltre l’uso di questo metodo confrontando la percentuale relativa di organelli mobili retrogradi e anterogradili, nonché la distribuzione della velocità di trasporto.

Protocol

La cura e il trattamento degli animali in questo protocollo sono stati eseguiti sotto la supervisione e l’approvazione del Comitato universitario di Tel Aviv per l’etica animale. 1. Preparazione MFC Fusione PDMS negli stampi primari (Figura 1) Acquistare o creare stampi primari (wafer) seguendo un protocollo dettagliato9. Utilizzare l’aria pressurizzata per rimuovere qualsiasi tipo di sporco dalla piattaforma wa…

Representative Results

Seguendo il protocollo descritto, gli espiantati embrionali HB9::GFP del midollo spinale sono stati coltivati in MFC (Figura 4A). Gli espiantati sono stati coltivati per 7 giorni, quando gli assoni sono stati completamente attraversati nel vano distale. Mitotracker Deep Red e Lysotracker Coloranti rossi sono stati aggiunti ai compartimenti distale e prossimali al fine di etichettare i mitocondri e scomparti acidi (Figura …

Discussion

In questo protocollo, descriviamo un sistema per monitorare il trasporto assonale di mitocondri e compartimenti acidi nei motoneuroni. Questa piattaforma in vitro semplificata consente un controllo preciso, il monitoraggio e la manipolazione dei compartimenti neuronali subcellulari, consentendo l’analisi sperimentale delle funzioni locali dei motoneuroni. Questo protocollo può essere utile per studiare malattie MN come la SLA, per concentrarsi sulla comprensione del meccanismo sottostante di disfunzione del trasporto as…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Israel Science foundation (ISF, 561/11) e del Consiglio europeo della ricerca (ERC, 309377).

Materials

35mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD35-100
50mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD camera Andor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) Sigma-Aldrich C1768 stock of 2mM in filtered DDW
B-27 Supplement (50X) Thermo Fisher 17504044
BDNF Alomone Labs B-250 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Biopsy punch 1.25mm World Precision Instruments WPI 504530 For preperation of large MFC
Biopsy punch 6mm World Precision Instruments WPI 504533 For preperation of small MFC
Biopsy punch 7mm World Precision Instruments WPI 504534 For preperation of large MFC
Bitplane Imaris software – version 8.4.1 Imaris
Bovine Serum Albumine (BSA) Sigma-Aldrich #A3311-100G 5% w/v in ddw
Chlorotrimetylsilane Sigma-Aldrich #386529-100ML
CNTF Alomone Labs C-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Density Gradient Medium – Optiprep Sigma-Aldrich D1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN-25 stock 10mg/mL in neurobasal
Dow Corning High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA For epoxy mold preperation
DPBS 10X Thermo Fisher #14200-067 dilute 1:10 in ddw
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm F.S.T 1125520
Epoxy Hardener Trias Chem S.R.L IPE 743 For epoxy mold preperation
Epoxy Resin Trias Chem S.R.L RP 026UV For epoxy mold preperation
FIJI software ImageJ
GDNF Alomone Labs G-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Glutamax 100X Thermo Fisher #35050-038
HB9:GFP mice strain Jackson Laboratories 005029
HBSS 10X Thermo Fisher #14185-045 Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter
iQ software Andor
Iris scissors, curved, 10 cm AS Medizintechnik 11-441-10
Iris scissors, straight, 9 cm AS Medizintechnik 11-440-09
Laminin Sigma-Aldrich #L-2020
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
LysoTracker Red Thermo Fisher L7528
Mitotracker Deep-Red FM Thermo Fisher M22426
Neurobasal medium Thermo Fisher 21103049
Nikon Eclipse Ti micorscope Nikon
Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution Biological Industries 03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO) Sigma-Aldrich #P8638 Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS
Sylgard 184 silicone elastomer kit DOW Corning Corporation #3097358-1004
Trypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich T1426 stock 25 mg/mL in 1XPBS
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade F.S.T 15000-00
Yokogawa CSU X-1 Yokogawa

Referências

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Citar este artigo
Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System. J. Vis. Exp. (159), e60993, doi:10.3791/60993 (2020).

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