עכבה מבוססי מדידה בזמן אמת של סרטן הגירה תאים ופלישה
Summary
סרטן היא מחלה קטלנית בשל יכולתה לעבור גרורות לאיברים שונים. קביעת היכולת של תאים סרטניים להגר ולפלוש תחת תנאי טיפול שונים חיונית להערכת אסטרטגיות טיפוליות. פרוטוקול זה מציג שיטה להעריך את היכולות גרורתית בזמן אמת של קו הסרטן הגלינובלסטומה.
Abstract
הסרטן מתעורר בשל התפשטות בלתי מבוקרת של תאים ביוזמת אי-יציבות גנטית, מוטציות, והסביבה גורמי מתח אחרים. אלה מומים שנרכשו ברשתות איתות מולקולריות מורכבות, לגרום להתפשטות והישרדות של תאים חריגה, השפלה מטריצה מרוכזת, גרורות לאיברים רחוקים. כ 90% של מקרי מוות הקשורים לסרטן מוערכים להיגרם על ידי אפקטים ישירים או עקיפים של הפצת גרורות. לכן, חשוב להקים מערכת מאוד אמינה ומקיפה כדי לאפיין את התנהגויות התא של הסרטן על מניפולציות גנטיות וסביבתיות. מערכת כזו יכולה לתת הבנה ברורה של הרגולציה המולקולרית של גרורות סרטן והזדמנות להתפתחות מוצלחת של אסטרטגיות מדויקות וטיפוליות. מכאן, קביעה מדויקת של התנהגויות תא סרטן כגון הגירה ופלישה עם רווח או אובדן של תפקוד של גנים (s) מאפשר הערכה של האופי האגרסיבי של תאים סרטניים. מערכת המדידה בזמן אמת מבוסס על עכבה התא מאפשר לחוקרים לרכוש ללא הרף נתונים במהלך ניסוי שלם ובאופן מיידי להשוות ולכמת את התוצאות בתנאים ניסיוניים שונים. שלא כמו שיטות קונבנציונליות, שיטה זו אינה דורשת קיבעון, כתמים ועיבוד לדוגמה לניתוח תאים העוברים או פולשים. נייר שיטה זה מדגיש הליכים מפורטים לקביעת זמן אמת של הגירה ופלישה של תאים הסרטניים gliנובלסטומה.
Introduction
סרטן היא מחלה קטלנית בשל יכולתה לעבור גרורות לאיברים שונים. קביעת גנוטיפים לסרטן ופנוטיפים הוא קריטי להבנת ולעצב אסטרטגיות טיפוליות אפקטיביות. עשורים של מחקר סרטן הובילו לפיתוח והסתגלות של שיטות שונות כדי לקבוע גנוטיפים הסרטן ופנוטיפים. אחת ההתפתחויות הטכניות העדכנית ביותר היא מדידה בזמן אמת של הגירה התא והפלישה מבוסס על עכבה תאים. הדבקה לתא לסובסטרטים ולאנשי קשר סלולריים ממלאים תפקיד חשוב בתקשורת ורגולציה של תא לתאים, פיתוח ותחזוקה של רקמות. חריגות בתא הדבקה להוביל לאובדן של מגע תא תא, השפלה של מטריקס מסחטות (ecm), ולהשיג יכולות נדידה והפולשים על ידי תאים, אשר כולם תורמים גרורות של תאים סרטניים לאיברים שונים1,2. שיטות שונות זמינים כדי לקבוע את הגירה התא (ריפוי פצע ו-boyden הלשכה הקאמרית) ואת הפלישה (שיטת מטריג’ל-boyden קאמרית)3,4,5. אלה שיטות קונבנציונליות הן חצי כמותית, כי התאים צריכים להיות מתויג עם צבע פלורסנט או צבעים אחרים או לפני או אחרי הניסוי כדי למדוד פנוטיפים תא. בנוסף, יש צורך בהפרעות מכניות במקרים מסוימים ליצירת פצע למדידת הגירה של תאים לאתר הפצע. יתר על כן, שיטות אלה קיימות צורכת זמן, אינטנסיבי עבודה, ולמדוד את התוצאות רק פעם אחת בלבד. בנוסף, שיטות אלה נוטות לבצע מדידות לא מדויקות עקב טיפול לא עקבי במהלך ההליך הניסיוני6.
שלא כמו שיטות קונבנציונליות, מערכת ניתוח התא בזמן אמת מודד העכבה התא בזמן אמת מבלי לדרוש טרום או כתמים ונזק מכני של תאים. וחשוב מכך, ניתן להאריך את משך הניסוי כך שניתן יהיה לקבוע את ההשפעות הביולוגיות באופן תלוי-זמן. ביצוע הניסוי הינו יעיל בזמן ולא מעמיק לעבודה. ניתוח נתונים הוא פשוט יחסית ומדויק. לעומת שיטות אחרות, שיטה זו היא אחת המידות הטובות ביותר בזמן אמת כדי למדוד הגירה תא ופלישה6,7,8,9.
Giaever ו Keese היו הראשונים לתאר את המדידה מבוססת עכבה של אוכלוסיית התא על פני השטח של אלקטרודות10. מערכת ניתוח התא בזמן אמת פועלת על אותו עיקרון. השטח של כל מיקרופלייט היטב הוא כ 80% מכוסה במערך של מיקרואלקטרודות זהב. כאשר שטח האלקטרודה משטח מאוכלס על ידי תאים בשל דבקות או התפשטות של התאים, העכבה החשמלית משתנה. עכבה זו מוצגת כאינדקס התא, אשר ביחס ישיר לתאים המכסים את שטח פני האלקטרודה לאחר שהם חודרים קרום מיקרונקבובי (גודל הנקבובית החציוני של קרום זה הוא 8 μm)11.
Crk ו crk הם מתאם חלבונים המכילים SH2 ו SH3 תחומים ולשחק תפקידים חשובים בפונקציות הסלולר השונות, כגון רגולציה השלד ציטותא, המרת תאים, התפשטות, הדבקה, אפיתל-mesenchymal מעבר, הגירה, פלישה, ו גרורות על-ידי מדיטינג אינטראקציות חלבון,17,14חלבון מסלולים15,16רבים איתות1,12,13 . שמונה עשרה לכן, חשוב לקבוע את Crk/Crk התלוי ביכולות הנדידה פולשנית של תאים סרטניים. בזמן אמת ניתוח התא בוצע כדי לקבוע את היכולות נדידה פולשנית של תאים גלינובלסטומה על הסתרה גן של Crk ו-Crk.
נייר שיטה זה מתאר מדידות מפורטות של הגירה Crk-ו-Crk-תיווך ופלישה של תאים גלינובלסטומה אנושיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
המדידה בזמן אמת של הגירה התא והפלישה באמצעות מערכת ניתוח התא בזמן אמת הוא תהליך פשוט, מהיר, ניטור רציף עם מספר רב, יתרונות משמעותיים על השיטות המסורתיות המספקים נתונים בנקודה אחת בזמן. כמו בשיטות המסורתיות, התנאים הניסיוניים חייבים להיות ממוטבים עבור כל קו תאים עבור מערכת ניתוח התא בזמן אמ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאוליביה פאנק על הסיוע הטכני שלה עם נתוני מערכת ניתוח תאים בזמן אמת. כמו כן אנו מודים למרכז הכתיבה הרפואית של מרסי הילדים בקנזס סיטי על עריכת כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן טום Ke, מוענק לחקר הסרטן ילדים (כדי TP) ועל ידי מרסי לילדים החולים המערב התיכון סרטן הברית שותף המייעצת המועצה מימון (כדי TP).
Materials
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | Co2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
Referências
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
- Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
- Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).
- Scrace, S., O’Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
- Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
- Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
- Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).
- Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
- Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).
