O câncer é uma doença letal devido à sua capacidade de metástase para diferentes órgãos. Determinar a capacidade das células cancerígenas de migrare e invadir diversas condições de tratamento é crucial para avaliar estratégias terapêuticas. Este protocolo apresenta um método para avaliar as habilidades metastáticas em tempo real de uma linha de células cancerígenas do glioblastoma.
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Artigo de método
Medição em tempo real da migração e invasão de células cancerígenas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O câncer surge devido à proliferação descontrolada de células iniciada por instabilidade genética, mutações e fatores ambientais e outros fatores de estresse. Essas anormalidades adquiridas em redes de sinalização molecular complexas e multicamadas induzem a proliferação e sobrevivência de células aberrantes, degradação da matriz extracelular e metástase em órgãos distantes. Estima-se que aproximadamente 90% das mortes relacionadas ao câncer sejam causadas pelos efeitos diretos ou indiretos da disseminação metastática. Por isso, é importante estabelecer um sistema altamente confiável e abrangente para caracterizar comportamentos de células cancerígenas em manipulações genéticas e ambientais. Tal sistema pode dar uma clara compreensão da regulação molecular da metástase do câncer e da oportunidade para o desenvolvimento bem-sucedido de estratégias terapêuticas estratificadas e precisas. Assim, a determinação precisa de comportamentos de células cancerígenas como migração e invasão com ganho ou perda de função de genes permite avaliar a natureza agressiva das células cancerosas. O sistema de medição em tempo real baseado na impedância celular permite que os pesquisadores adquiram continuamente dados durante todo um experimento e comparem e quantifiquem instantaneamente os resultados em várias condições experimentais. Ao contrário dos métodos convencionais, este método não requer fixação, coloração e processamento de amostras para analisar células que migram ou invadem. Este artigo do método enfatiza procedimentos detalhados para determinação em tempo real da migração e invasão de células cancerígenas de glioblastoma.
Introdução
O câncer é uma doença letal devido à sua capacidade de metástase para diferentes órgãos. Determinar genótipos e fenótipos do câncer é fundamental para compreender e projetar estratégias terapêuticas eficazes. Décadas de pesquisa sobre câncer levaram ao desenvolvimento e adaptação de diferentes métodos para determinar genótipos e fenótipos do câncer. Um dos mais recentes desenvolvimentos técnicos é a medição em tempo real da migração celular e invasão baseada na impedância celular. A adesão celular a substratos e contatos celulares desempenham um papel importante na comunicação e regulação celular-célula, desenvolvimento e manutenção de tecidos. Anormalidades na adesão....
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Protocolo
NOTA: Todos os materiais de cultura celular precisam ser estéreis e todo o experimento deve ser realizado em um gabinete de biossegurança em condições estéreis.
1. Cultura e Eletroporação da Linha Celular de Glioblastoma U-118MG
- Cultura A linha celular U-118MG em 5% de soro bovino fetal (FBS) contendo o DMEM (meio de cultura) de Dulbecco e manter a 37 °C em uma atmosfera úmida contendo 5% de incubadora de CO2 (condições de cultura).
- Use células saudáveis de 70% a 80% para eletroporação.
- Para colher células, lave as células que crescem em pratos de cultura com 1x PBS e adicione 2 mL d....
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Resultados
Foi sugerido que crk e CrkL são importantes para migração celular e invasão em diferentes linhas de células cancerígenas13,17. Embora as proteínas Crk e CrkL sejam estruturalmente e funcionalmente semelhantes umas às outras e joguem funções sobrepostas essenciais16,,19,,20,21, muitos estudos de knockdown genético para Crk e CrkL não abo.......
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Discussão
A medição em tempo real da migração e invasão de células usando o sistema de análise celular em tempo real é um processo de monitoramento simples, rápido e contínuo com múltiplas vantagens significativas sobre os métodos tradicionais que fornecem dados em um único ponto de tempo. Assim como os métodos tradicionais, as condições experimentais devem ser otimizadas para cada linha celular para o sistema de análise celular em tempo real, pois cada linha celular pode ser diferente em termos de sua adesão ao substrato, crescim.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Agradecemos olivia funk por sua assistência técnica com os dados do sistema de análise celular em tempo real. Também agradecemos ao Centro de Escrita Médica do Children's Mercy Kansas City pela edição deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (to TP) e pelo Children's Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Board (para TP).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Gabinete de biossegurança | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Classe II, Tipo A2 | |
| Placas CIM | Divisão de Análise Celular da Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Placas de invasão e migração celular |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 e ID: 3524 | |
| Dulbecco' s águia modificada' s meio (DMEM) | ATCC | 302002 | Meio de cultura usado para cultura de células |
| salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS usado para lavar as células |
| Soro fetal bovino (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i Incubadora de CO2 | ThermoFisher Scientific | 51030285 | CO2 incubadora |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Gel de matriz extracelular |
| Sistema de eletroporação de néon | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Sistema de eletroporação |
| Sistema de transfecção de néon 10 µ Kit L | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Kit de eletroporação |
| SiRNA não direcionado | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA para controle não targado |
| Odyssey CLx (sistema de imagem) | LI-COR Biosciences | Sistema de imagem Western blot | |
| Software RTCA Divisão | de Análise Celular da Agilent Technologies, Inc | Instrumento usado para experimento | |
| Contador | de células automatizado portátil | Millipore | C85360 |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Linhas celulares usadas para experimentos |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrumento usado para experimentos |
Referências
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144
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Reimpressões e permissões
