Impedans-baseret Real-time Måling af Kræft Cell Migration og Invasion
Summary
Kræft er en dødelig sygdom på grund af dens evne til at metastasere til forskellige organer. Bestemmelse af kræftcellers evne til at migrere og invadere under forskellige behandlingsbetingelser er afgørende for at vurdere terapeutiske strategier. Denne protokol præsenterer en metode til at vurdere real-time metastatiske evner af en glioblastomkræft cellelinje.
Abstract
Kræft opstår på grund af ukontrolleret spredning af celler initieret af genetisk ustabilitet, mutationer, og miljømæssige og andre stressfaktorer. Disse erhvervede abnormiteter i komplekse, flerlagede molekylære signalnetværk fremkalde afvigende celleproliferation og overlevelse, ekstracellulær matrix nedbrydning, og metastase til fjerne organer. Ca. 90 % af de kræftrelaterede dødsfald skønnes at være forårsaget af de direkte eller indirekte virkninger af metastatisk formidling. Derfor er det vigtigt at etablere en meget pålidelig, omfattende system til at karakterisere kræft celle adfærd på genetiske og miljømæssige manipulationer. Et sådant system kan give en klar forståelse af den molekylære regulering af kræftmetastase og mulighed for en vellykket udvikling af lagdelte, præcise terapeutiske strategier. Derfor, nøjagtig bestemmelse af kræft celle adfærd såsom migration og invasion med gevinst eller tab af funktion af gen (r) giver mulighed for vurdering af den aggressive karakter af kræftceller. Realtidsmålesystemet baseret på celleimpedans gør det muligt for forskere løbende at hente data under et helt eksperiment og straks sammenligne og kvantificere resultaterne under forskellige eksperimentelle forhold. I modsætning til konventionelle metoder kræver denne metode ikke fiksering, farvning og prøvebehandling for at analysere celler, der migrerer eller invaderer. Denne metode papir understreger detaljerede procedurer for real-time bestemmelse af migration og invasion af glioblastoma kræftceller.
Introduction
Kræft er en dødelig sygdom på grund af dens evne til at metastasere til forskellige organer. Bestemmelse af kræft genotyper og fænotyper er afgørende for at forstå og designe effektive terapeutiske strategier. Årtiers kræftforskning har ført til udvikling og tilpasning af forskellige metoder til at bestemme kræft genotyper og fænotyper. En af de seneste tekniske udviklinger er real-time måling af celle migration og invasion baseret på celle impedans. Cellevedhæftning til substrater og cellecellekontakter spiller en vigtig rolle i celle-til-celle kommunikation og regulering, udvikling og vedligeholdelse af væv. Abnormiteter i cellevedhæftning fører til tab af cellecellekontakt, nedbrydning af ekstracellulær matrix (ECM) og gevinst af cellers vandrende og invaderende evner, som alle bidrager til metastase af kræftceller til forskellige organer1,2. Forskellige metoder er til rådighed til at bestemme cellemigration (sårheling og Boyden kammer analyser) og invasion (Matrigel-Boyden kammer assay)3,4,5. Disse konventionelle metoder er semikvantitative, fordi celler skal mærkes med et fluorescerende farvestof eller andre farvestoffer enten før eller efter forsøget for at måle cellefænotyper. Derudover er der i nogle tilfælde behov for mekaniske forstyrrelser for at skabe et sår til måling af cellernes migration til sårstedet. Desuden er disse eksisterende metoder tidskrævende, arbejdskrævende, og måle resultaterne på kun ét tidspunkt. Desuden er disse metoder tilbøjelige til at foretage unøjagtige målinger på grund af inkonsekvent håndtering under forsøgsproceduren6.
I modsætning til konventionelle metoder måler realtidscelleanalysesystemet celleimpedans i realtid uden at kræve præ- eller poststaining og mekanisk skade af celler. Endnu vigtigere er det, at et eksperiments varighed kan forlænges, så biologiske virkninger kan bestemmes på en tidsafhængig måde. Udførelse af eksperimentet er tidseffektivt og ikke arbejdskrævende. Det er relativt enkelt og præcist at analysere data. Sammenlignet med andre metoder er denne metode en af de bedste målinger i realtid til måling af cellemigration og invasion6,7,8,9.
Giaever og Keese var de første til at beskrive impedansbaseret måling af en cellepopulation på overfladen af elektroderne 10. Realtidscelleanalysesystemet fungerer efter samme princip. Arealet af hver mikroplade brønd er ca. 80% dækket med en række guld mikroelektroder. Når elektrodens overfladeareal er besat af celler på grund af vedhæftning eller spredning af cellerne, ændres den elektriske impedans. Denne impedans vises som celleindekset, som er direkte proportional med de celler, der dækker elektrodeoverfladeområdet, efter at de trænger ind i mikroporøs membranen (medianporestørrelsen af denne membran er 8 μm)11.
Crk og CrkL er adaptor proteiner, der indeholder SH2 og SH3 domæner og spiller vigtige roller i forskellige cellulære funktioner, såsom cytoskeleton regulering, celle transformation, spredning, vedhæftning, epitel-mesenkymale overgang, migration, invasion, og metastase ved at mægle protein-protein interaktioner i mange signalveje1,12,13, 14,,1515,16,1713, kr. Derfor er det vigtigt at bestemme crk/crkl-afhængige vandrende og invasive kapaciteter af kræftceller. Realtidscelleanalyse blev udført for at bestemme glioblastomcellers vandrende og invasive evner ved genknockdown af Crk og CrkL.
Denne metode papir beskriver detaljerede målinger af Crk- og CrkL-medieret migration og invasion af menneskelige glioblastomceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Realtidsmålingen af cellemigrering og invasion ved hjælp af realtidscelleanalysesystemet er en enkel, hurtig og kontinuerlig overvågningsproces med flere, betydelige fordele i forhold til de traditionelle metoder, der leverer data på et enkelt tidspunkt. Som med de traditionelle metoder skal forsøgsbetingelserne optimeres for hver cellelinje til realtidscelleanalysesystemet, fordi hver cellelinje kan være forskellig med hensyn til dets vedhæftning til substratet, vækst, celle-til-celle kontakter og træk- og inva…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Olivia Funk for hendes tekniske hjælp med data fra realtidscelleanalysesystemet. Vi takker også Medical Writing Center på Children’s Mercy Kansas City for at redigere dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af Tom Keaveny Begavet Fond for Pædiatrisk Cancer Research (til TP) og af Children’s Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Board finansiering (til TP).
Materials
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | Co2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
Referências
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
- Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
- Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).
- Scrace, S., O’Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
- Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
- Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
- Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).
- Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
- Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).
