Impedanzbasierte Echtzeitmessung der Krebszellmigration und -invasion
Summary
Krebs ist eine tödliche Krankheit aufgrund seiner Fähigkeit, auf verschiedene Organe metastasieren. Die Bestimmung der Fähigkeit von Krebszellen, unter verschiedenen Behandlungsbedingungen zu wandern und einzudringen, ist entscheidend für die Beurteilung therapeutischer Strategien. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Beurteilung der metastasierenden Fähigkeiten einer Glioblastom-Krebszelllinie in Echtzeit dar.
Abstract
Krebs entsteht durch unkontrollierte Proliferation von Zellen, die durch genetische Instabilität, Mutationen sowie Umwelt- und andere Stressfaktoren ausgelöst werden. Diese erworbenen Anomalien in komplexen, mehrschichtigen molekularen Signalnetzwerken induzieren aberrante Zellproliferation und Überleben, extrazellulären Matrixabbau und Metastasierung enferner Organe. Schätzungen zufolge werden etwa 90 % der krebsbedingten Todesfälle durch die direkten oder indirekten Auswirkungen der metastasierenden Verbreitung verursacht. Daher ist es wichtig, ein hochzuverlässiges, umfassendes System zur Charakterisierung des Verhaltens von Krebszellen bei genetischen und Umweltmanipulationen zu etablieren. Ein solches System kann ein klares Verständnis der molekularen Regulation von Krebsmetastasen und die Möglichkeit für eine erfolgreiche Entwicklung geschichteter, präziser therapeutischer Strategien vermitteln. Daher ermöglicht eine genaue Bestimmung von Krebszellverhalten wie Migration und Invasion mit Gewinn oder Verlust der Funktion der Gene(n) die Beurteilung der aggressiven Natur von Krebszellen. Das auf Derimpedanz basierende Echtzeit-Messsystem ermöglicht es Forschern, während eines ganzen Experiments kontinuierlich Daten zu erfassen und die Ergebnisse unter verschiedenen experimentellen Bedingungen sofort zu vergleichen und zu quantifizieren. Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden erfordert diese Methode keine Fixierung, Färbung und Probenverarbeitung, um Zellen zu analysieren, die migrieren oder eindringen. Dieses Methodenpapier legt den Schwerpunkt auf detaillierte Verfahren zur Echtzeitbestimmung der Migration und Invasion von Glioblastom-Krebszellen.
Introduction
Krebs ist eine tödliche Krankheit aufgrund seiner Fähigkeit, auf verschiedene Organe metastasieren. Die Bestimmung von Krebsgenotypen und Phänotypen ist entscheidend für das Verständnis und die Entwicklung wirksamer therapeutischer Strategien. Jahrzehnte der Krebsforschung haben zur Entwicklung und Anpassung verschiedener Methoden zur Bestimmung von Krebsgenotypen und Phänotypen geführt. Eine der neuesten technischen Entwicklungen ist die Echtzeitmessung der Zellmigration und -invasion auf der Grundlage der Zellimpedanz. Die Zellhaftung an Substraten und Zell-Zell-Kontakten spielt eine wichtige Rolle bei der Zell-zu-Zell-Kommunikation und -Regulierung, Entwicklung und Pflege von Geweben. Anomalien in der Zelladhäsion führen zum Verlust des Zell-Zell-Kontakts, zum Abbau der extrazellulären Matrix (ECM) und zur Verstärkung von Migrations- und Invasionsfähigkeiten durch Zellen, die alle zur Metastasierung von Krebszellen in verschiedene Organe beitragen1,2. Verschiedene Methoden stehen zur Verfügung, um die Zellmigration (Wundheilung und Boyden-Kammer-Assays) und Invasion (Matrigel-Boyden Chamber Assay)3,4,5zu bestimmen. Diese konventionellen Methoden sind semiquantitativ, da Zellen vor oder nach dem Experiment mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder anderen Farbstoffen gekennzeichnet werden müssen, um Zellphänotypen zu messen. Darüber hinaus sind in einigen Fällen mechanische Störungen erforderlich, um eine Wunde zur Messung der Migration von Zellen an die Wundstelle zu bilden. Darüber hinaus sind diese bestehenden Methoden zeitaufwändig, arbeitsintensiv und messen die Ergebnisse nur zu einem Zeitpunkt. Darüber hinaus sind diese Methoden anfällig für ungenaue Messungen aufgrund inkonsistenter Handhabung während des experimentellen Verfahrens6.
Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden misst das Echtzeit-Zellanalysesystem die Zellimpedanz in Echtzeit, ohne dass eine Vor- oder Nachfärbung und mechanische Beschädigung von Zellen erforderlich ist. Noch wichtiger ist, dass die Dauer eines Experiments verlängert werden kann, so dass biologische Effekte zeitabhängig bestimmt werden können. Die Durchführung des Experiments ist zeiteffizient und nicht arbeitsintensiv. Die Analyse von Daten ist relativ einfach und genau. Im Vergleich zu anderen Methoden ist diese Methode eine der besten Echtzeitmessungen zur Messung der Zellmigration und Invasion6,7,8,9.
Giaever und Keese waren die ersten, die die Impedanz-basierte Messung einer Zellpopulation auf der Oberfläche von Elektroden10 beschrieben. Das Echtzeit-Zellanalysesystem arbeitet nach dem gleichen Prinzip. Die Fläche jedes Mikroplattenbrunnens ist zu ca. 80% mit einer Reihe von Goldmikroelektroden bedeckt. Wenn die Elektrodenoberfläche aufgrund der Haftung oder Desasion der Zellen von Zellen belegt wird, ändert sich die elektrische Impedanz. Diese Impedanz wird als Zellindex angezeigt, der direkt proportional zu den Zellen ist, die die Elektrodenoberfläche abdecken, nachdem sie die mikroporöse Membran durchdrungen haben (die mittlere Porengröße dieser Membran beträgt 8 m)11.
Crk und CrkL sind Adapterproteine, die SH2- und SH3-Domänen enthalten und spielen eine wichtige Rolle in verschiedenen zellulären Funktionen, wie Zytoskelettregulation, Zelltransformation, Proliferation, Adhäsion, epithelialer-mesenchymaler Übergang, Migration, Invasion und Metastasierung durch Vermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in vielen Signalwegen1,12,13,14,15,16,17, 18. Daher ist es wichtig, die Crk/CrkL-abhängigen Migrations- und invasiven Fähigkeiten von Krebszellen zu bestimmen. Die Echtzeit-Zellanalyse wurde durchgeführt, um die migrations- und invasiven Fähigkeiten von Glioblastomzellen nach dem Gen-Knockdown von Crk und CrkL zu bestimmen.
Dieses Methodenpapier beschreibt detaillierte Messungen der crk- und CrkL-vermittelten Migration und Invasion menschlicher Glioblastomzellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Echtzeitmessung der Zellmigration und -invasion mit hilfe des Echtzeit-Zellanalysesystems ist ein einfacher, schneller und kontinuierlicher Überwachungsprozess mit mehreren, signifikanten Vorteilen gegenüber den herkömmlichen Methoden, die Daten zu einem einzigen Zeitpunkt bereitstellen. Wie bei den herkömmlichen Methoden müssen die experimentellen Bedingungen für jede Zelllinie für das Echtzeit-Zellanalysesystem optimiert werden, da jede Zelllinie hinsichtlich ihrer Haftung auf dem Substrat, dem Wachstum, den…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Olivia Funk für ihre technische Unterstützung bei den Echtzeit-Zellanalysesystemdaten. Wir danken auch dem Medical Writing Center bei Children es Mercy Kansas City für die Bearbeitung dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde von Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (to TP) und von Children es Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Board (to TP) unterstützt.
Materials
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | Co2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
Referências
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
- Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
- Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).
- Scrace, S., O’Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
- Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
- Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
- Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).
- Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
- Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).
