בידוד מיו-בריאלס מבריות מביופסיות שריר השלד וקביעת תפקוד מתכווץ עם מתמר כוח רזולוציה ננו-ניוטון
Summary
מוצג כאן פרוטוקול כדי להעריך את המאפיינים ההתכווצות של שרירים מחוסנים myofibrils עם רזולוציית ננו ניוטון. הפרוטוקול משתמש בהתקנה עם גשוש כוח אופטי מבוסס אינטרפרומטריה. הגדרה זו יוצרת נתונים עם יחס אות לרעש גבוה ומאפשרת הערכה של קינטיקה מתכוובת של myofibrils.
Abstract
תאי שריר מחוסנים הם הכרחיים לפעילות של בני אדם ובעלי חיים. סיבי שריר יחיד מורכבים myofibrils, אשר מורכבים סרקומרים מקושרים באופן סדרתי, יחידות כיווץ הקטן ביותר בשריר. תפקוד סרקומרי תורם חולשת שרירים בחולים עם מוטציות בקידוד גנים עבור חלבונים סרקומריים. המחקר של מכניקה myofibril מאפשר הערכה של אינטראקציות actin-מיוסין ללא השפעות מבלבלות פוטנציאליות של מיו-בריאן פגום, סמוך בעת מדידת ההתכווצות של סיבי שריר יחיד. נזק אולטרה-סטרו-סטרו-סטריאלי ואי-יישור של מיו-בריאן עשויים לתרום להתכווצות לקויה. אם קיים נזק מבני ב myofibrils, הם צפויים לשבור במהלך הליך הבידוד או במהלך הניסוי. יתר על כן, מחקרים ב myofibrils לספק את ההערכה של אינטראקציות actin-מיוסין בנוכחות האילוצים הגיאומטריים של הסרקומרים. לדוגמה, מדידות ב myofibrils יכול להאיר אם תפקוד myofibrillar היא ההשפעה העיקרית של מוטציה בחלבון סרקומרי. בנוסף, עירוי עם פתרונות סידן או תרכובות הוא כמעט מיידי בשל הקוטר הקטן של myofibril. זה עושה myofibrils מתאים במידה רבה כדי למדוד את שיעורי ההפעלה והרפיה במהלך ייצור כוח. הפרוטוקול המתואר במאמר זה משתמש בבדיקה של כוח אופטי המבוססת על העיקרון של אינטרפרומטר Fabry-Pérot המסוגל למדוד כוחות בטווח ננו-ניוטון, בשילוב מנוע אורך piezo ומערכת התזת צעד מהירה. הגדרה זו מאפשרת את המחקר של מכניקה myofibril עם מדידות כוח ברזולוציה גבוהה.
Introduction
תאי שריר מחוסנים הם הכרחיים עבור פעילויות חיי היומיום. תנועת גפיים, תפקוד נשימתי, ותנועת שאיבה של הלב להסתמך על הכוח שנוצר על ידי תאי שריר. שריר השלד מורכב fascicles שריר המכיל חבילות של סיבי שריר יחיד(איור 1A). סיבי שריר אלה מורכבים myofibrils, אשר נוצרים על ידי סרקומרים מקושרים באופן סדרתי (איור 1B,D). הסרקומרים מכילים נבטים דקים ועבים. אלה מורכבים בעיקר משרשראות של מולקולות אקין ומיוסין, בהתאמה(איור 1B). אינטראקציות Actin-מיויסין אחראים על יכולת ייצור כוח של שריר. חולים עם מוטציות בגנים קידוד חלבונים סרקומריים, כגון ערפילין, א-אקטין, וטרופונין T, סובלים חולשת שרירים עקב תפקודלקוי 1.
את איכות התכווצויות השרירים ניתן ללמוד ברמות שונות של הארגון, החל בשרירים שלמים vivo כדי אינטראקציות actin-myosin במבחנה motility אומר. במהלך העשורים האחרונים פיתחו מספר קבוצות מחקר הגדרות כדי לקבוע את ההתכווצות של myofibrilsבודדים 2, 3,4,,55,6,7,8,9,10. הגדרות אלה מבוססות על זיהוי של שינויים בהטיית לייזר מ cantilever (כלומר, סטיית קרן אופטית) הנגרמת על ידי התכווצות myofibril (לפרטים, ראה Labuda ואח’11). למרות קביעת הפונקציה ההתכווצות של myofibrils יש כמה מגבלות (למשל, הדינמיקה של תהליכי צימוד התכווצות-התכווצות הדרה כי הם במעלה הזרם של myofibrils חסרים), ישנם יתרונות מרובים לגישה זו. אלה כוללים: 1) את היכולת להעריך אינטראקציות actin-myosin בנוכחות האילוצים הגיאומטריים של הסרקומרים; 2) היכולת להעריך אינטראקציות actin-myosin ללא השפעות מבלבלות פוטנציאליות של מיופילים פגומים, סמוכים (בעת מדידת ההתכווצות של סיבי שריר יחיד נזק אולטרסטרוקטואלי ויישור של myofibrils עשוי לתרום להתכווצות לקויה) (איור 1D); 3) הקוטר הקטן של myofibrils (~ 1 μm, איור 2A)וחוסר קרום לאפשר דיפוזיה סידן כמעט מיידית לתוך הסרקומרים. יתר על כן, אם נזק מבני קיים ב myofibrils, הם צפויים לשבור במהלך הבידוד שלהם או במהלך הניסוי. לפיכך, הערכת התכווצות myofibril היא שיטה אלגנטית ללמוד את המנגנונים הבסיסיים של התכווצות שרירים ולהבין אם אינטראקציות א-אקטין-מיויסין מופרעות הן הגורם העיקרי למחלת שרירים הנגרמת על ידי מוטציות בחלבונים סרקומריים.
פרוטוקול זה מציג התקנה חדשה שפותחה כדי לקבוע את ההתכווצות של myofibrils המשלבת בדיקה כוח cantilever עם רזולוציית ננו-ניוטון (כלומר, Optiforce). גשוש כוח זה מבוסס על עקרון האינטרפרומטריה. אינטרפרומטריה מאפשרת שימוש בטילברים נוקשים יחסית. זה מאפשר למדוד כוח עם הסטה קטנה של cantilever, מתקרב התכווצויות איזומטריות של myofibril. הגשושית מאפשרת הערכה של כוחות פסיביים ופעילים נמוכים המיוצרים על ידי מיופיל אחד מבודד מבריופסיות שרירים שונות, כולל אלה של בני אדם, עם יחס אות לרעש גבוה. הגשושית האופטית של כוח cantilever המשולבת בהתקנה זו מבוססת על אינטרפרומטר Fabry-Pérot12. האינטרפרומטר מזהה תזוזות קטנות בין סיב אופטי לבין קטילבר מצופה זהב המותקן על פרול(איור 3). הפער בין הסיב האופטי לבין ה-cantilever נקרא חלל פברי-פרוט. Myofibrils מותקנים בין הגשוש מנוע piezo באמצעות שני סיבי זכוכית מצופה דבק הרכבה. הכוח המיוצר על ידי myofibril יכול להיות נגזר מתמטית מנתוני interferometer. אינטרפרומטריה מבוססת על מיקום העל או הפרעה של שני גלים או יותר (בהתקנה זו שלושה גלי אור). אור לייזר עם אורך גל בין 1,528.77-1,563.85 ננומטר נפלט מהאינטרפרומטר ונשלח דרך הסיב האופטי. בגשוש, האור משתקף 1) בממשק בין הסיב האופטי למדיום(איור 3A); 2) בממשק של המדיום ואת cantilever (איור 3B); ו 3) בממשק בין ציפוי מתכת וזהב של cantilever (איור 3C). ההשתקפות בממשק A ו- B תלויה במדד שבירה (n) של המדיום שבו הגשוש שקוע. האור, המורכב משלוש ההשתקפויות על-ידי, חוזר לפוטודיודה באינטרפרומטר. הפוטודיודה מודדת את עוצמת האור, שהיא תוצאה של דפוס ההפרעה של שלוש ההשתקפויות המודחות. כאשר כוח מתכווץ נוצר על ידי הפעלה או מתיחה myofibril, myofibril מושך על cantilever. תנועה זו משנה את גודל החלל(ד) וכתוצאה מכך, את מספר אורכי הגל המתאימים לחלל. האור הממוקם ב-cantilever יהיה שלב אחר, וכתוצאה מכך דפוס הפרעה שונה. הפוטודיודה מתעדת את השינוי הזה בעוצמת תבנית ההפרעה כשינוי בוולטס. לאחר מכן, דור כוח myofibril מחושב משינוי זה, תוך מתן בחשבון את נוקשות cantilever. גשושית הכוח מכוילת על ידי היצרן על ידי דחיפת קצה מחט ההרכבה, מחובר לקצה ההצמדה החופשי של cantilever, נגד סולם שקילה תוך שמירה על כיפוף של cantilever שווה כפול של אורך הגל של לייזר קריאה13. לכן, אינטרפרומטריה היא שיטה רגישה מאוד לזיהוי שינויים קטנים במרחק, המאפשר מדידה של כוחות עם רזולוציית ננו-ניוטון. החלטה זו מאפשרת הערכה של ייצור כוח myofibrillar עם יחס אות לרעש גבוה. בעוד אינטרפרומטריה מסורתית מגבילה את טווח המידות לחלק הליניארי של עקומת ההפרעה, באמצעות מגברים נעילה ואפנן של אורך גל הלייזר מתגבר עלמגבלה זו 14. הדבר מוסבר ביתר פירוט בסעיף הדיון.
כדי למדוד את המתח הפעיל myofibril, מערכת התזת צעד מהיר שולבה כדי לחשוף את myofibril לפתרונותסידן (איור 4A). מערכת ההתמהמה המהירה מאפשרת שינויי פתרון להתרחש בתוך 10 ms. בגלל הקוטר הקטן שלהם, דיפוזיה סידן לתוך myofibrils הוא כמעט מיידי. לפיכך, מערכת זו מתאימה במיוחד למדידת שיעורי כריכת actin-myosin במהלך ההפעלה ושחרור במהלך הרפיה. ניתן לקבוע את קצב ההפעלה (kACT)ואת ההרפיה (kREL)מהקימורים להרפיה של ההפעלה. כמו כן, על ידי חשיפת myofibrils לפתרונות סידן של הגדלת הריכוז, יחסי כוח סידן ורגישות סידן ניתן לקבוע.
יתר על כן, מנוע אורך piezo מאפשר מתיחות וקיצור מהיר של myofibril. זה מציע את האפשרות ללמוד את המאפיינים ויסולסטי (כלומר, מתח פסיבי) של myofibril, כמו גם ביצוע קיצור מהיר של מיופיל כדי לקבוע את קצב פיתוח מחדש מתח (kTR). הפרמטרים שאוחזרו מניסווני מתח אקטיביים ופסיביים יכולים להשתנות על ידי מוטציות גנטיות בחלבון סרקומרי.
התקנה זו שנבנתה בהתאמה אישית שימשה כדי למדוד את המאפיינים האקטיביים והפסיביים של myofibrils מבודדים משריר בריא של אדם, מטופל ושרד עכבר.
Protocol
Representative Results
Discussion
מתואר הוא פרוטוקול כדי להעריך את הפונקציה ההתכווצות של myofibrils מבודד מרקמות שריר השלד אדם או בעלי חיים. פתרון הכוח של התקנה זו תואר בעבר על ידי Chavan ואח ‘12. בקיצור, הוא נקבע על ידי תנודות אקראיות של אורך חלל Fabry-Pérot שנוצר בין סיבי הזיהוי cantilever, אשר מייצרים את החלק הדומיננטי של הרעש ב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה מומן על ידי AFM-Telethon וקרן בניין כוח עבור מיופתיה Nemaline. המחברים רוצים להכיר את היוצר של המוצרים המוזכרים במאמר זה, IONOptix Inc.
Materials
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
References
- Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
- Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, 535-548 (1997).
- Kulke, M., et al. a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle. Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).
- Stehle, R., et al. Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Research in Cardiology. 97, 127-135 (2002).
- Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).
- Ribeiro, P. A. B., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Joureau, B., et al. Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3). Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).
- de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).
- Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils. Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).
- Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
- Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface. Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).
- Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation. Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).
- Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout. Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).
- van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).
- Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. , (2019).
- Winter, J. M., et al. Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy. Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).
- Ottenheijm, C. A. C., et al. Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy. Brain. 136, 1718-1731 (2013).
- Ribeiro, P. A., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).
- Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
- Najafi, A., et al. End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium. Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).
