Isolera Myofibrils från skelettmuskulatur tarmbiopsier och bestämma Contractile funktion med en Nano-Newton Resolution Force Transducer
Summary
Presenteras här är ett protokoll för att bedöma de kontraktila egenskaperna hos striated muskel myofibrils med nano-Newton upplösning. Protokollet använder en inställning med en interferometri-baserad, optisk kraft sond. Denna inställning genererar data med hög signal-brus-förhållande och möjliggör bedömning av myofibrils kontraktila kinetik.
Abstract
Striated muskelceller är oumbärliga för aktiviteten hos människor och djur. Single muskelfibrer består av myofibrils, som består av seriellt länkade sarkomerer, de minsta kontraktila enheter i muskel. Sarcomeric dysfunktion bidrar till muskel svaghet hos patienter med mutationer i gener kodning för sarkomiska proteiner. Studiet av myofibril mekanik möjliggör bedömning av aktin-myosin interaktioner utan potentiella confounding effekter av skadade, intilliggande myofibrils vid mätning av kontraktilitet av enstaka muskelfibrer. Ultrastructural skador och feljustering av myofibrils kan bidra till nedsatt kontraktilitet. Om strukturella skador är närvarande i myofibrils, de sannolikt bryta under isoleringen förfarandet eller under experimentet. Vidare ger studier i myofibrils bedömningen av aktin-myosin interaktioner i närvaro av de geometriska begränsningar av sarkomerna. Till exempel kan mätningar i myofibrils klargöra om myofibrillar dysfunktion är den primära effekten av en mutation i ett sarkomiskt protein. Dessutom perfusion med kalcium lösningar eller föreningar är nästan omedelbar på grund av den lilla diametern på myofibril. Detta gör myofibrils synnerligen lämplig att mäta andelen aktivering och avkoppling under kraftproduktion. Det protokoll som beskrivs i detta dokument använder en optisk kraft sond baserad på principen om en Fabry-Pérot interferometer kan mäta krafter i nano-Newton sortiment, kopplade till en piezo längd motor och en snabb-steg perfusion system. Denna uppställning möjliggör studier av myofibrilmekanik med högupplösningskraftmätningar.
Introduction
Striated muskelceller är oumbärliga för dagliga livsaktiviteter. Lem rörelse, andningsfunktion, och pumpning rörelse i hjärtat lita på den kraft som genereras av muskelceller. Skelettmuskel består av muskelfascitappar som innehåller buntar av enstaka muskelfibrer (Figur 1A). Dessa muskelfibrer består av myofibrils, som bildas av seriekopplade sarkomerer (Figur 1B,D). Sarkomerna innehåller tunna och tjocka glödtrådar. Dessa består i första hand av kedjor av aktin och myosinmolekyler, respektive (Figur 1B). Actin-myosin interaktioner är ansvariga för kraft-genererande kapacitet av muskel. Patienter med mutationer i gener kodning för sarkomiska proteiner, såsom nebulin, aktin, och troponin T, lider av muskelsvaghet på grund av kontraktil dysfunktion1.
Kvaliteten på muskelkontraktilitet kan studeras på olika nivåer av organisation, allt från in vivo hela muskler till aktin-myosin interaktioner i in vitro motility analyser. Under de senaste decennierna har flera forskargrupper utvecklat uppställningar för att bestämma kontraktiliteten hos enskilda myofibrils2,3,4,5,6,7,8,9,10. Dessa uppställningar är baserade på detektion av förändringar i laser avböjning från en cantilever (dvs, optiska strålen avböjning) som orsakas av kontraktion av myofibril (för detaljer, se Labuda et al.11). Även om fastställandet av kontraktil funktion myofibrils har vissa begränsningar (t.ex. dynamiken i excitation-kontraktionskoppling processer som är uppströms av myofibrils saknas), det finns flera fördelar med detta tillvägagångssätt. Dessa inkluderar: 1) förmågan att bedöma aktin-myosin interaktioner i närvaro av de geometriska begränsningar av sarkomerna; 2) förmågan att bedöma aktin-myosin interaktioner utan potentiella confounding effekter av skadade, intilliggande myofibrils (vid mätning av kontraktilitet av single muskelfibrer ultrastrukturella skador och feljustering av myofibrils kan bidra till nedsatt kontraktilitet) (Figur 1D); 3) den lilla diametern på myofibrils (~1 μm, figur 2A) och bristen på membran möjliggör nästan omedelbar kalcium diffusion in i sarkomerna. Vidare, om strukturella skador finns i myofibrils, de sannolikt bryta under sin isolering eller under experimentet. Därför bedöma myofibril kontraktilitet är en elegant metod för att studera de grundläggande mekanismerna för muskelkontraktion och att förstå om störd aktin-myosin interaktioner är den främsta orsaken till muskelsjukdom som orsakas av mutationer i sarcomeric proteiner.
Detta protokoll presenterar en nyutvecklad setup för att fastställa kontraktility av myofibrils införliva en cantilever kraft sond med nano-Newton upplösning (dvs. Optiforce). Denna kraftsond bygger på interferometriprincipen. Interferometry möjliggör användning av relativt styva kantilevers. Detta gör det möjlighet för att mäta styrka med lite avböjning av cantileveren som att närma sig isometric sammandragningar av myofibrilen. Sonden möjliggör bedömning av låga passiva och aktiva krafter som produceras av en enda myofibril isolerad från olika muskelbiopsier, inklusive de från mänskliga försökspersoner, med en hög signal-brus-förhållande. Den optiska cantilever kraft sond införlivas i denna setup är baserad på en Fabry-Pérot interferometer12. Interferometern detekterar små förskjutningar mellan en optisk fiber och en guldbelagd cantilever monterad på en ferrule (Figur 3). Mellanrummet mellan den optiska fibern och cantileveren kallas Fabry-Pérot håligheten. Myofibrils monteras mellan sonden och piezomotorn med hjälp av två limbelagda glasmonteringsfibrer. Kraften som produceras av myofibrilen kan matematiskt härledas från interferometerdatan. Interferometri baseras på superpositionen eller störningen av två eller flera vågor (i denna setup tre ljusvågor). Laserljus med en våglängd mellan 1 528,77–1 563,85 nm avges från interferometern och skickas genom den optiska fibern. I sonden reflekteras ljuset 1) vid gränssnittet mellan den optiska fibern och mediet (Bild 3A); 2) vid gränssnittet för mediet och den kantilever (Figur 3B); och 3) vid gränssnittet mellan metall- och guldbeläggningen på cantilever (figur 3C). Reflektionen vid gränssnitt A och B är beroende av brytningsindexet (n) för det medium där sonden är nedsänkt. Ljuset, som består av de tre överlagrade reflexerna, återgår till en fotodiod i interferometern. Fotodioden mäter ljusets intensitet, vilket är resultatet av interferensmönstret hos de tre överlagrade reflexerna. När kontraktil kraft genereras genom att aktivera eller sträcker en myofibril, den myofibril drar på cantilever. Denna rörelse ändrar hålighetsstorleken (d) och följaktligen antalet våglängder som passar i hålrummet. Ljuset som reflekteras vid cantilever kommer att ha en annan fas, vilket resulterar i ett annat störningsmönster. Fotodioden registrerar denna förändring av störningsmönster intensitet som en förändring i Volts. Därefter är myofibril kraft generation beräknas från denna förändring, med hänsyn till den cantilever styvhet. Kraftsonden kalibreras av tillverkaren genom att trycka på tippen på monteringsnålen, fäst vid fri handingänden på fri handborttagningen, mot en vågvåg samtidigt som böjningen av frisläppen är lika med en multipel av avläsningslasernsvåglängd 13. Således är interferometri en mycket känslig metod för att upptäcka små förändringar i avstånd, vilket möjliggör mätning av krafter med nano-Newton upplösning. Denna resolution möjliggör bedömningen av myofibrillar kraftproduktion med hög signal-brus-förhållande. Medan traditionella interferometri begränsar mätområdet till den linjära delen av störningskurvan, med hjälp av en inlåsningsförstärkare och modulering av laservåglängden övervinner denna begränsning14. Detta förklaras närmare i diskussionsavsnittet.
För att mäta myofibril aktiv spänning, en snabb-steg perfusion system införlivades för att exponera den myofibril till kalcium lösningar (Figur 4A). Perfusionssystemet med snabbstegs-kan lösningsändringar ske inom 10 ms. På grund av deras lilla diameter, är calciumdiffusion in i myofibrilsen nästan ögonblicklig. Därav, detta system är särskilt lämplig för att mäta satserna för actin-myosin bindning under aktivering och release under avkoppling. Aktiveringshastigheten (kACT) och avslappning (kREL) kan bestämmas från aktivering-avkopplingskurvorna. Också, genom att utsätta myofibrils för kalcium lösningar av ökande koncentration, kraft-kalcium relation och kalcium känslighet kan bestämmas.
Vidare möjliggör en motor med piezolängd snabb sträckning och förkortning av myofibrilen. Detta erbjuder möjligheten att studera de viskoelastiska egenskaperna (dvs, passiv spänning) av myofibril, samt utför en snabb förkortning och restretch av myofibril att bestämma graden av spänning ombyggnad (kTR). De parametrar som hämtas från både aktiva och passiva spänningsexperiment kan ändras av genmutationer i ett sarkomiskt protein.
Denna specialbyggda setup användes för att mäta aktiva och passiva contractile egenskaper myofibrils isolerade från friska mänskliga, patient och mus skelettmuskulaturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrivs är ett protokoll för att bedöma kontraktil funktion myofibrils isolerade från mänskliga eller djur skelettet muskel vävnader. Kraftupplösningen av denna uppställning har beskrivits tidigare av Chavan et al.12. Kort sagt, det bestäms av slumpmässiga fluktuationer av längden på Fabry-Pérot hålighet bildas mellan detektion fiber och cantilever, som producerar den dominerande delen av buller vid utgången av avläsningen (uttryckt i V) som, multiplicerat med avböjning känsligh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta projekt finansierades av AFM-Telethon och A Foundation Building Strength för Nemaline Myopathies. Författarna vill erkänna skaparen av de produkter som nämns i denna artikel, IONOptix Inc.
Materials
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
References
- Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
- Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, 535-548 (1997).
- Kulke, M., et al. a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle. Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).
- Stehle, R., et al. Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Research in Cardiology. 97, 127-135 (2002).
- Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).
- Ribeiro, P. A. B., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Joureau, B., et al. Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3). Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).
- de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).
- Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils. Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).
- Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
- Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface. Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).
- Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation. Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).
- Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout. Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).
- van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).
- Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. , (2019).
- Winter, J. M., et al. Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy. Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).
- Ottenheijm, C. A. C., et al. Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy. Brain. 136, 1718-1731 (2013).
- Ribeiro, P. A., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).
- Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
- Najafi, A., et al. End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium. Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).
