Análise de Citometria de Fluxo de Subconjuntos de Células Imunes dentro do Baço de Murina, Medula Óssea, Linfonodos e Tecido Sinovial em um Modelo de Osteoartrite

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado e reprodutível de citometria de fluxo para identificar subconjuntos de monócito/macrófago e células T usando ensaios de coloração extra e intracelular dentro do baço de murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial, utilizando um modelo cirúrgico estabelecido de osteoartrite de murina.

Abstract

A osteoartrite (OA) é uma das doenças musculoesqueléticos mais prevalentes, afetando pacientes que sofrem de dor e limitações físicas. Evidências recentes indicam um potencial componente inflamatório da doença, com células T e monócitos/macrófagos potencialmente associados à patogênese de OA. Outros estudos postularam um papel importante para subconjuntos de ambas as linhagens celulares inflamatórias, como linfócitos de th1, th2, th17 e t-regulatory, e M1, M2, e macrófagos residentes em tecido sinovium. No entanto, a interação entre a resposta celular inflamatória sinovial local e sistêmica e as mudanças estruturais na articulação é desconhecida. Para entender perfeitamente como as células T e os monócitos/macrófagos contribuem para o OA, é importante ser capaz de identificar quantitivamente essas células e seus subconjuntos simultaneamente em tecido sinovial, órgãos linfáticos secundários e sistematicamente (o baço e a medula óssea). Hoje em dia, os diferentes subconjuntos de células inflamatórias podem ser identificados por uma combinação de marcadores de superfície celular tornando a citometria de fluxo multicolorida uma técnica poderosa na investigação desses processos celulares. Neste protocolo, descrevemos etapas detalhadas relativas à colheita de tecido sinovial e órgãos linfáticos secundários, bem como a geração de suspensões de células únicas. Além disso, apresentamos um ensaio de coloração extracelular para identificar monócitos/macrófagos e seus subconjuntos, bem como um ensaio de coloração extra e intracelular para identificar células T e seus subconjuntos dentro do baço de murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial. Cada etapa deste protocolo foi otimizada e testada, resultando em um ensaio altamente reprodutível que pode ser utilizado para outros modelos de camundongos OA cirúrgicos e não cirúrgicos.

Introduction

A osteoartrite (OA) é uma doença debilitante e dolorosa que envolve várias patologias de todos os tecidos associados à articulação¹. Afetando aproximadamente 3,8% da população global², o AA é uma das doenças musculoesqueléticos mais prevalentes e deve se tornar a^4ª principal causa de incapacidade em todo o mundo até 2020³. OA pós-traumático ocorre após uma lesão articular e representa pelo menos 12% de todos os OA e até 25% de OA em articulações suscetíveis como o joelho^4,,5. Além disso, a lesão articular aumenta o risco de vida útil de OA em mais de cinco^{vezes 6}. Nem todas as lesões com instabilidade aparentemente semelhante continuarão a desenvolver OA e, portanto, a definição de fatores que impulsionam o risco OA de longo prazo permanece desafiadora. É fundamental desenvolver tratamentos eficazes para prevenir e/ou tratar o OA pós-traumático, investigar e definir melhor a patologia, causas e mecanismos específicos da lesão que predispõem à OA¹.

OA e sua definição de destruição da cartilagem foram previamente atribuídas inteiramente ao estresse mecânico e, portanto, a OA foi considerada uma doença não inflamatória². No entanto, estudos mais recentes têm mostrado uma infiltração inflamatória de membranas sinoviais e um aumento de células inflamatórias no tecido sinovial em pacientes com OA em comparação com controles saudáveis², lançando luz sobre um componente inflamatório como uma potencial força motriz em OA. Outros estudos indicaram que anormalidades tanto no perfil das células T CD4+ quanto em CD8+, bem como monócitos/macrófagos do sistema imunológico inato podem contribuir para a patogênese de OA^2,7. Investigações detalhadas sobre essas anormalidades revelaram funções relevantes para vários subconjuntos de células T², como as populações normando Th1^8,Th2⁹, Th17⁸ e T (Treg)^10,11. Apesar dessa evidência convincente, a relação causal entre a alteração das respostas das células T e o desenvolvimento e progressão da OA ainda é desconhecida².

Além de células T específicas terem um papel em OA, estudos recentes sugerem que macrófagos polarizados/ativados diferencialmente podem estar associados à patogênese de OA¹². Em particular, macrófagos originários de monócitos sanguíneos se acumulam no sinolio e polarizam-se em macrófagos ativados clássicamente (M1) ou macrófagos ativados alternativamente (M2) durante o desenvolvimento de OA, implicando uma correlação entre macrófagos derivados de monocitos e OA¹³. Em contraste, certos subconjuntos de macrófagos povoam órgãos precocemente durante o desenvolvimento e auto-sustentam seus números em uma matéria independente monócito¹⁴. Recentemente, uma função de proteção articular mediada por uma barreira de junção apertada foi mostrada para esses macrófagos residentes em tecido sinovial (STRMs)¹⁴. Esses achados indicam que anormalidades em subconjuntos de macrófagos em particular podem desempenhar um papel crucial durante o desenvolvimento do OA. No entanto, as interações entre essa resposta inflamatória celular e as mudanças estruturais na articulação posterior ao trauma são desconhecidas.

Historicamente, a análise das células imunes no tecido sinovial foi restrita à imunohistoquímica (IHC) ou à expressão mRNA por reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) se aproxima^15,,16. No entanto, tanto o IHC quanto o RT-PCR não têm a capacidade de identificar vários tipos de células diferentes e seus subconjuntos simultaneamente, limitando assim a aplicabilidade desses métodos. Além disso, o IHC limita-se à análise de pequenas amostras de tecido e pode perder acúmulos de células inflamatórias focais. Ao longo dos últimos anos, uma miríade de marcadores superficiais para vários tipos de células foram desenvolvidos, e subconjuntos de células imunes podem agora ser identificados de forma confiável por combinações distintas desses marcadores. Devido ao progresso técnico constante, os citómetros de fluxo são agora capazes de identificar uma infinidade de diferentes fluorochromes simultaneamente permitindo a análise de grandes painéis de anticorpos multicoloridos.

A citometria de fluxo fornece aos pesquisadores uma técnica poderosa que permite a identificação simultânea e quantificação de uma infinidade de células imunes e seus subconjuntos no nível único das células. Desenvolvemos e otimizamos tanto um ensaio de coloração extracelular para identificar monócitos/macrófagos e seus subconjuntos, bem como um ensaio de coloração extra/intracelular para identificar células T e seus subconjuntos dentro do baço murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial. Cada etapa deste protocolo foi otimizada e testada resultando em um ensaio altamente reprodutível que pode ser utilizado para outros modelos de camundongos OA cirúrgicos e não cirúrgicos¹⁷.

Protocol

O Comitê de Ética Animal do Distrito Sanitário Local de Sydney aprovou todos os procedimentos mencionados neste protocolo. Os camundongos são alojados e cuidados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Health and Medical Research Council of Australia Revised 2010). Para todos os experimentos de 10 a 12 semanas de idade, foram utilizados camundongos C57BL/6 masculinos. NOTA: Para induzir o OA pós-traumático, foi realizada a desestabi…

Representative Results

Os resultados representativos do painel de subconjunto de monócito e do painel de subconjunto de células T são descritos abaixo. A Figura 1 ilustra a estratégia hierárquica de gating para o painel de subconjunto de monócitos em células imunes recolhidas da medula óssea de animais tratados com DMM. A mesma estratégia foi utilizada e verificada em todos os outros tipos de tecidos. Ao configurar o experimento, a tensão de Área de Dispersão Para a Frente (…

Discussion

Os métodos descritos neste protocolo foram projetados e testados para identificar de forma confiável vários subconjuntos de monócitos/macrófagos e células T dentro do baço de murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial em um modelo de murina de osteoartrite (OA). O protocolo atual pode ser facilmente modificado para investigar diferentes tipos de tecidos, ou outros tipos de células, trocando anticorpos, e pode ser usado para modelos murinos alternativos de OA. Ao testar outros tipos de tecidos, é fundame…

Materials

APC anti-mouse CD194 (CCR4)	BioLegend	131212	T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst	BD	566385	Buffers
Fixable Viability Stain 510, 100 µg	BD	564406	T-Cell Panel
Fixable Viability Stain 510, 100 µg	BD	564406	Monocyte Panel
Liberase, Research Grade	Roche	5401127001	Enzyme for synovial tissue
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg	BD	564985	Monocyte Panel
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg	BD	562454	Monocyte Panel
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg	BD	742274	T-Cell Panel
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg	BD	565250	Monocyte Panel
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg	BD	563061	T-Cell Panel
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg	BD	557596	T-Cell Panel
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg	BD	552775	T-Cell Panel
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg	BD	565480	T-Cell Panel
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg	BD	565261	T-Cell Panel
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg	BD	740664	T-Cell Panel
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg	BD	563687	Monocyte Panel
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg	BD	563332	T-Cell Panel
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg	BD	565411	Monocyte Panel
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg	BD	560408	T-Cell Panel
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg	BD	563414	Monocyte Panel
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg	BD	560593	Monocyte Panel
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg	BD	560600	Monocyte Panel
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg	BD	564143	T-Cell Panel
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg	BD	562894	T-Cell Panel
Red Blood Cell Lysing Buffer	N/A	N/A	Buffers	Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .
Transcription Factor Buffer Set 100Tst	BD	562574	Buffers