骨关节炎模型中骨髓、骨髓、淋巴结和合成组织内免疫细胞子集的流动细胞测量分析
Summary
在这里，我们描述了一个详细和可重复的流细胞学方案，利用穆林骨关节炎的既定手术模型，使用细胞外和细胞内染色测定，确定单细胞/巨噬细胞和T细胞子集。
Abstract
骨关节炎 （OA） 是最常见的肌肉骨骼疾病之一，影响患者遭受疼痛和身体限制。最近的证据表明，该病的潜在炎症成分，T细胞和单核细胞/巨噬细胞可能与OA的发病机制有关。进一步的研究假设了炎症细胞系子集（如Th1、Th2、Th17和T-调节淋巴细胞）以及M1、M2和合成组织驻留巨噬细胞的重要作用。然而，局部突触和全身炎症细胞反应与关节结构变化之间的相互作用尚不得而知。为了充分了解T细胞和单细胞/巨噬细胞如何对OA的贡献，重要的是能够在突触组织、继发淋巴器官和系统（脾脏和骨髓）中同时大量识别这些细胞及其子集。如今，不同的炎症细胞子集可以通过细胞表面标记的组合来识别，使多色流细胞仪成为研究这些细胞过程的有力技术。在该协议中，我们描述了有关合成组织和继发淋巴器官的收获以及单细胞悬浮液的生成的详细步骤。此外，我们同时提供细胞外染色测定，以识别单细胞/巨噬细胞及其子集，以及一个细胞外染色和细胞内染色检测，以识别T细胞及其子集内的骨髓脾脏，骨髓，淋巴结和合成组织。该协议的每一步都经过优化和测试，结果可以进行高度可重复的检测，可用于其他手术和非手术 OA 小鼠模型。
Introduction
骨关节炎（OA）是一种使人衰弱和痛苦的疾病，涉及与关节1相关的所有组织的各种病理。OA是最常见的肌肉骨骼疾病之一，到2020年成为全球第四大残疾病因。创伤后OA发生在关节损伤后，在易感关节（如膝关节4、5）中，至少占所有OA的12%和OA的25%。此外，关节损伤使OA的终生风险增加5倍以上。并非所有明显类似的伤害都会继续发展OA，因此，驱动长期OA风险的决定性因素仍然具有挑战性。为了开发预防和治疗创伤后OA的有效治疗方法，调查和更好地定义容易患OA 1的损伤特异性病理学、病因和机制，这一点至关重要。
OA及其定义软骨破坏以前完全归因于机械应力，因此，OA被认为是一种非炎症性疾病2。然而，最近的研究表明，与健康对联2相比，OA患者的突触膜的炎症渗透和炎症细胞的增加，使炎症成分成为OA的潜在驱动力。2进一步的研究表明，CD4+和CD8+T细胞型的异常以及先天免疫系统的单核细胞/巨噬细胞都可能导致OA2，7的发病机制。详细调查这些异常发现各种T细胞子集2的相关作用，如Th1 8，Th29，Th178和T调控（特雷格）群体910，11。10,11尽管有这种令人信服的证据，T细胞反应的改变与OA的发展与进展之间的因果关系仍然不为人知。
除了在OA中发挥作用的特定T细胞外，最近的研究表明，分化的极化/激活的巨噬细胞可能与OA12的发病机制有关。特别是，来自血液单核细胞的巨噬细胞在合成中积累并极化成经典激活的巨噬细胞（M1）或OA发育期间的替代激活巨噬细胞（M2），这意味着单细胞衍生巨噬细胞和OA13之间的相关性。相比之下，某些巨噬细胞的子集在发育早期填充器官，并在单核细胞独立物质14中自我维持其数量。最近，这些突触组织-居民巨噬细胞（STRMs）14显示由紧密结阻屏障调解的关节保护功能。这些发现表明，异常，特别是巨噬细胞子集，可能在OA的发育过程中发挥关键作用。然而，这种炎症性细胞反应和创伤后关节的结构变化之间的相互作用是未知的。
从历史上看，通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法15，16，对突触组织中免疫细胞的分析仅限于免疫组织化学（IHC）或mRNA,表达。然而，IHC和RT-PCR都缺乏同时识别多个不同细胞类型及其子集的能力，因此限制了这些方法的适用性。此外，IHC仅限于分析小组织样本，并可能错过焦点炎症细胞积累。在过去的几年中，已经开发出了各种细胞类型的无数表面标记，免疫细胞的子集现在可以通过这些标记的不同组合可靠地识别出来。由于技术的进步，流动细胞计现在能够同时识别多种不同的氟化物，从而能够分析大型多色抗体面板。
流细胞学为研究者提供了一种强大的技术，允许在单细胞水平上同时识别和量化大量免疫细胞及其子集。我们开发和优化了细胞外染色分析，以识别单细胞/巨噬细胞及其子集，以及额外的/细胞内染色检测，以识别T细胞及其子集在骨髓脾脏，骨髓，淋巴结和合成组织。该协议的每一步都进行了优化和测试，结果一个高度可重复的检测，可用于其他手术和非手术OA小鼠模型17。
Protocol
Representative Results
Discussion
本协议中描述的方法经过设计和测试，能够可靠地识别骨髓脾脏、骨髓、淋巴结和骨髓（OA）骨髓模型中的单细胞/巨噬细胞和T细胞的各种子集。通过交换抗体，可以方便地修改当前协议，以研究不同的组织类型或其他细胞类型，并可用于OA的替代穆林模型。在测试其他组织类型时，由于免疫细胞的表面标记在20组织中不同，因此测试每个抗体的特异性至关重要。此外，在交换抗?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢安德鲁林，博士和吉尔斯贝斯特，博士，他们在建立流动细胞仪的帮助。该项目得到了授予PH的德国 Forschungsgemeinschaft （DFG-HA 8481/1-1） 的支持。
Materials
| APC anti-mouse CD194 (CCR4) | BioLegend | 131212 | T-Cell Panel | |
| Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst | BD | 566385 | Buffers | |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | T-Cell Panel | |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | Monocyte Panel | |
| Liberase, Research Grade | Roche | 5401127001 | Enzyme for synovial tissue | |
| Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg | BD | 564985 | Monocyte Panel | |
| Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg | BD | 562454 | Monocyte Panel | |
| Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg | BD | 742274 | T-Cell Panel | |
| Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg | BD | 565250 | Monocyte Panel | |
| Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg | BD | 563061 | T-Cell Panel | |
| Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg | BD | 557596 | T-Cell Panel | |
| Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg | BD | 552775 | T-Cell Panel | |
| Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg | BD | 565480 | T-Cell Panel | |
| Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg | BD | 565261 | T-Cell Panel | |
| Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg | BD | 740664 | T-Cell Panel | |
| Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg | BD | 563687 | Monocyte Panel | |
| Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg | BD | 563332 | T-Cell Panel | |
| Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg | BD | 565411 | Monocyte Panel | |
| Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg | BD | 560408 | T-Cell Panel | |
| Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg | BD | 563414 | Monocyte Panel | |
| Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg | BD | 560593 | Monocyte Panel | |
| Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg | BD | 560600 | Monocyte Panel | |
| Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg | BD | 564143 | T-Cell Panel | |
| Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg | BD | 562894 | T-Cell Panel | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | N/A | N/A | Buffers | Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): . |
| Transcription Factor Buffer Set 100Tst | BD | 562574 | Buffers |
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