इंट्रासिस्टर्नल इंजेक्शन के माध्यम से लेप्टोमेनिंगियल कोशिकाओं संशोधन का शामिल
Summary
हम एक इंट्रासिस्टर्नल इंजेक्शन का वर्णन करते हैं जो खोपड़ी को स्थिर किए जा सकने वाले टिप पर सुई तुला को नियोजित करता है, इस प्रकार अंतर्निहित परान्चिमा को नुकसान के जोखिम को नष्ट करता है। दृष्टिकोण आनुवंशिक भाग्य मानचित्रण और लेप्टोमेनिंगियल कोशिकाओं के जोड़तोड़ और सेरेब्रोस्पाइनल द्रव आंदोलन पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Abstract
यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल में अंतर्निहित परान्चिमा को नुकसान के जोखिम को नष्ट करते हुए सिस्टर्ना मैग्ना के माध्यम से समाधानों को सुरक्षित रूप से और मैन्युअल रूप से इंजेक्ट करने का वर्णन किया गया है। पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल सीधे सुइयों का उपयोग करने की सलाह देते हैं जिन्हें ड्यूरल सतह से अधिकतम 1-2 मिमी तक कम किया जाना चाहिए। ड्यूरल झिल्ली पंचर होने के बाद प्रतिरोध में अचानक गिरावट से सुई को स्थिर स्थिति में बनाए रखना मुश्किल हो जाता है। हमारी विधि, बजाय, टिप पर एक सुई तुला को रोजगार देता है जिसे खोपड़ी की ऑक्सीपिटल हड्डी के खिलाफ स्थिर किया जा सकता है, इस प्रकार ड्यूरल झिल्ली के छिद्र के बाद सिरिंज को ऊतक में प्रवेश करने से रोकता है। प्रक्रिया सीधी, प्रजनन योग्य है, और संचालित जानवरों में लंबे समय तक चलने वाली असुविधा का कारण नहीं बनती है। हम संवहनी लेप्टोमेनिंगल कोशिकाओं के आनुवंशिक भाग्य मानचित्रण के संदर्भ में इंट्रासिस्टर्नल इंजेक्शन रणनीति का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, इसी तकनीक का उपयोग अनुसंधान प्रश्नों की एक विस्तृत श्रृंखला को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि न्यूरोडेवलपमेंट में लेप्टोमेनिंग्स की भूमिका की जांच करना और इन घटनाओं में चित्रित जीन के आनुवंशिक एब्लेशन के माध्यम से बैक्टीरियल दिमागी पहचान पत्र के प्रसार की जांच करना । इसके अतिरिक्त, प्रक्रिया को निरंतर वितरण के लिए एक स्वचालित जलसेक प्रणाली के साथ जोड़ा जा सकता है और फ्लोरोसेंटी लेबल वाले अणुओं के इंजेक्शन के माध्यम से सेरेब्रोस्पाइनल द्रव आंदोलन को ट्रैक करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
Introduction
लेप्टोमेनिंगल कोशिकाएं मस्तिष्क को ओवरलेइंग करने वाली पतली परत में आयोजित कोशिकाओं की फाइब्रोब्लास्ट जैसी आबादी हैं और कोलेजन क्रॉसलिंकिंग (जैसे, डीसीएन और लम)में फंसाए गए जीन को व्यक्त करती हैं, और मस्तिष्क-मेनिंगल बैरियर (जैसे, Cldn11)1,,2की स्थापना में। लेप्टोमेनिंगल कोशिकाओं को शारीरिक कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला में फंसाया जाता है, सेरेब्रोस्पाइनल द्रव जल निकासी3 पर सख्त नियंत्रण से विकासशील मस्तिष्क4,,5में तंत्रिका जनकों के मार्गदर्शन तक। हाल के एक अध्ययन में यह भी प्रस्ताव किया गया है कि नवजात शिशु में लेप्टोमेनिंग रेडियल ग्लिया जैसी कोशिकाओं को आश्रय दे सकते हैं जो मस्तिष्क परेंचिमा में स्थानांतरित हो जाते हैं और कार्यात्मक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स6में विकसित होते हैं।
लेप्टोमेनिंगल कोशिकाएं सतह एस्ट्रोसाइट्स के निकट निकटता में स्थित हैं और उनके साथ साझा करते हैं, साथ ही अन्य पैरान्चिमल एस्ट्रोग्लिया, कॉनक्सिन-30 (Cx30)7की अभिव्यक्ति। नीचे उल्लिखित शल्य चिकित्सा प्रक्रिया ट्रांसजेनिक चूहों के सिस्टर्ना मैग्ना में एंडोस्सेफेन के एक बार वितरण के माध्यम से इन मेनिंगल कोशिकाओं की व्यापक और विशिष्ट लेबलिंग की अनुमति देती है, जो Cx30+ कोशिकाओं में टीडीटमाटर को सशर्त व्यक्त करता है (यानी, भाग्य मानचित्रण के लिए क्रेयर-लोक्सपी प्रणाली का उपयोग करना)। एंडोक्सिफेन टैमोक्सिफेन का एक सक्रिय मेटाबोलाइट है और टैमोक्सिफेन के समान क्रेयर-व्यक्त कोशिकाओं के पुनर्संयोजन को प्रेरित करता है। हालांकि, यह सामयिक आवेदन के लिए अनुशंसित समाधान है क्योंकि यह इथेनॉल की उच्च सांद्रता के बजाय 5-10% डीएमएसओ में घुल जाता है। इसके अतिरिक्त, एंडोक्सिफेन मस्तिष्क-मेनिंगल बाधा को पार नहीं करता है, जिससे अंतर्निहित Cx30+ खगोलीय आबादी (प्रतिनिधि परिणामदेखें) की लेबलिंग के बिना लेप्टोमेनिंगियल कोशिकाओं के विशिष्ट पुनर्संयोजन को सक्षम करता है।
यहां प्रस्तुत तकनीक का उद्देश्य सिस्टर्ना मैग्ना तक सीधी पहुंच के माध्यम से सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ में यौगिक को मैन्युअल और सुरक्षित रूप से इंजेक्ट करना है। अन्य, अधिक आक्रामक प्रक्रियाओं के विपरीत, क्रैनिओटॉमी की आवश्यकता होती है, यह दृष्टिकोण खोपड़ी या मस्तिष्क पैरान्चिमा को नुकसान पहुंचाए बिना यौगिकों को बढ़ावा देने की अनुमति देता है। इस प्रकार, यह पैरान्चिमल ग्लिया कोशिकाओं की सक्रियता से शुरू हुई भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को शामिल करने से जुड़ा नहीं है। 8,,9,,10से पहले वर्णित अन्य इंजेक्शन रणनीतियों के समान, वर्तमान दृष्टिकोण ओवरलेलिंग गर्दन की मांसपेशियों के कुंद विच्छेदन के बाद, सिस्टर्ना मैग्ना को कवर करने वाली अटलांटो-ऑक्सीपिटल ड्यूरल झिल्ली के सर्जिकल एक्सपोजर पर निर्भर करता है। हालांकि, अन्य प्रक्रियाओं के विपरीत, हम टिप पर झुका सुई के उपयोग की सलाह देते हैं, जिसे प्रशासन के दौरान ऑक्सीपिटल हड्डी के खिलाफ स्थिर किया जा सकता है। यह सुई के बहुत गहरे मर्मज्ञ और अंतर्निहित सेरिबैलम और मेडुला को नुकसान पहुंचाने के जोखिम को रोक देगा।
यह शल्य प्रक्रिया वंश ट्रेसिंग जांच के साथ संगत है जिसका उद्देश्य परन्चिमल परतों के माध्यम से सेल पहचान और माइग्रेशन मार्गों में परिवर्तन ों का मानचित्रण करना है। इसे आनुवंशिक एब्लेशन अध्ययनों के अनुकूल भी माना जा सकता है जो स्वास्थ्य और रोग में लेप्टोमेनिंगियल कोशिकाओं की भूमिका की जांच करने का इरादा रखते हैं, जैसे कॉर्टिकल विकास5 में उनका योगदान या बैक्टीरियल दिमागी दिमागीतालीम3,11का प्रसार। अंत में, इसका उपयोग जंगली प्रकार के जानवरों में फ्लोरोसेंट ट्रेसर के वितरण के साथ संयुक्त होने पर सेरेब्रोस्पाइनल द्रव आंदोलन को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल भाग्य मानचित्रण के लिए लेप्टोमेनिंगियल कोशिकाओं को लेबल करने के लिए एक सीधी और प्रजनन प्रक्रिया प्रस्तुत करता है। हम Cx30-क्रेयर में टीडीमैटो फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की अभिव्यक्त…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन स्वीडिश अनुसंधान परिषद, स्वीडिश कैंसर सोसायटी, सामरिक अनुसंधान के लिए स्वीडिश फाउंडेशन, Knut och ऐलिस Wallenbergs Stiftelse और स्टेम सेल और कारोलिंस्का संस्थान (StratRegen) में पुनर्योजी चिकित्सा में रणनीतिक अनुसंधान कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित था ।
Materials
| Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
| Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
| Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Hamilton syringe (30G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
| Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Shaver | Aesculap | GT420 | |
| Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
| Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
| Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |
Referências
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