En flaskhals i “design-build-test” cykel av mikrobiell teknik är den hastighet med vilken vi kan utföra funktionella skärmar av stammar. Vi beskriver en hög genomströmning metod för stam screening tillämpas på hundratals till tusentals jästceller per experiment som använder droplet-baserade RNA sekvensering.
De kraftfulla verktyg som finns tillgängliga för att redigera jäst genom har gjort denna mikrob en värdefull plattform för teknik. Även om det nu är möjligt att konstruera bibliotek av miljontals genetiskt distinkta stammar, screening för en önskad fenotyp är fortfarande ett betydande hinder. Med befintliga screeningtekniker finns det en avvägning mellan informationsutdata och genomströmning, med screening med hög genomströmning som vanligtvis utförs på en produkt av intresse. Därför presenterar vi en metod för att påskynda stam screening genom att anpassa single cell RNA sekvensering till isogenic picoliter kolonier av genetiskt modifierade jäst stammar. För att möta de unika utmaningarna med att utföra RNA-sekvensering på jästceller odlar vi isogena jästkolonier inom hydrogeler och spheroplast innan de utför RNA-sekvensering. RNA-sekvenseringsdata kan användas för att härleda jästfenotyper och reda ut konstruerade vägar. Skalbarheten för vår metod tar upp ett kritiskt hinder i mikrobiell teknik.
Ett primärt mål för mikrobiell teknik är att modifiera mikrober för att förmå dem att producera värdefulla föreningar1,2. S. cerevisiae har varit den primära organismen för mikrobiell ingenjörskonst på grund av dess enkel kultur och bredden av verktyg som finns tillgängliga för att konstruera sitt genom3,,4,5. Ett hinder kvarstår dock när det gäller att utföra funktionella skärmar på den modifierade jästen: screeninggenomströmning släpar efter genomteknik genom storleksordningar. Screening innebär vanligtvis isolera stammar i microwell plattor och fenotypning dem genom att mäta produktionen av en viss förening6,7. Genomströmningen av denna process begränsas av de stora mängder reagens som behövs för att analysera enskilda stammar i hundra mikroliterreaktioner. Dropp mikrofluidik ger en attraktiv lösning för att öka genomströmningen av jäst screening genom storleksordningar av nedskalning reaktioner normalt utförs i väl plattor8. Men som med väl plattan skärmar, droplet skärmar upptäcker vanligtvis enskilda produktföreningar, vilket ger begränsad information i den globala funktionen av den konstruerade vägen9,10,11.
RNA-sekvensering (RNA-seq) kan möjliggöra en mer omfattande karakterisering av utbildningsavsnitt genom att tillåta att uttrycksnivåer för alla relevanta gener kan bedömas samtidigt12,13. Dessutom tillåter droppmetoder tusentals celler att profileras per experiment, vilket ger det dataflöde som krävs för att kontrollera bibliotek av konstruerade varianter14,15. RNA-seq-metoder är dock optimerade för däggdjursceller. jäst, som jämförelse, har mindre mRNA per cell och en cellvägg som är svårt att ta bort16, utesluter deras sekvensering med befintliga metoder. Om en droppmetod med hög genomströmning skulle kunna utformas för att möjliggöra jäst RNA-seq, skulle det ge en skalbar, kostnadseffektiv och informationsrik fenotypning plattform för jäst teknik.
Vi presenterar ett detaljerat protokoll av vår nyligen utvecklade metod för sekvensering jästceller med hög genomströmning dropp mikrofluidik17. För att övervinna utmaningen med begränsad RNA kapslar vi in och odlar enda jästceller i picoliterhydrogelsfärer. Kultur duplicerar cellerna, vilket ger hundratals kopior som delar samma konstruerade väg; Detta minskar variationen på grund av encelliga genuttryck samtidigt som mängden RNA som är tillgängligt för sekvensering ökar avsevärt. Efter kultur-baserade förstärkning, vi spheroplast cellerna, ta bort cellväggen via bulk enzymatiska matsmältningen. Cellmembran förblir intakta, så att varje isogen koloni och dess associerade mRNA förblir inkapslade i sina hydrogelsfärer. Detta gör det möjligt för oss att para ihop de enskilda kolonierna med mRNA-fånga reagenser och lysbuffert, och mRNA som ska fångas, streckkoda och sekvenseras efter Drop-Seq-arbetsflödet14. Vår metod tillåter transkriptom-bred screening av tusentals isogenic jäst kolonier per experiment.
Vår metod för isogen jäst koloni RNA sekvensering (ICO-seq) anpassar en publicerad enda cell RNA sekvensering plattform, Drop-Seq, för hög genomströmning screening av konstruerade jäst stammar. Jästceller innehåller mindre än 10% av kopiorna av mRNA av en typisk däggdjurscell och har en cellvägg som måste brytas ned före mRNA-fångst16. Dessa två faktorer utesluter direkt applicering av jäst på Drop-Seq eller andra droppbaserade scRNA-seq-plattformar. För att ta itu med dessa frågor kapslar vi in enskilda celler i hydrogeler och odlar dem till kolonier för att ge tillräckligt med inmatningsmaterial för RNA-sekvensering och vi smälter jästcellväggen för att generera spheroplaster före lysning och mRNA-fångst. Dessa ändringar lägger till ytterligare komplexitet i ICO-seq-arbetsflödet jämfört med det ursprungliga Drop-Seq-arbetsflödet och är viktiga steg som användarna måste se till att gå smidigt.
Korrekt drift av anordning A är nödvändig för att kapsla in enstaka jästceller i agarose hydrogeler. Korrekt räkning av ingångsjästupphängningen måste följas för att minimera antalet hydrogeler med mer än en jästcell, samtidigt som man ser till att tillräckligt med hydrogeler innehåller en enda cell för att säkerställa en rimlig cellfångsteffektivitet under mRNA-fångst. Under mikrofluidisk användning måste agarosgelblandningen vara väl upplöst och passera genom ett sprutfilter för att minimera risken för igensättning av enheten. Den agaros gel blandningen är trögflytande och den region där en enda kanal delas upp i åtta är särskilt benägna att igensättning. Genom att centrera en höghastighetskamera för att visualisera enhetens funktion i enhetens region kan användarna övervaka enhetligheten hos droppar som kommer från var och en av de åtta kanalerna och snabbt reagera om enhetligheten ändras på grund av träskor i någon av kanalerna. Inspektion av en liten mängd uppsamlad emulsion under mikroskopet ger en sekundär metod för att bekräfta en högkvalitativ emulsion.
Efter tillväxt av jästkolonier inom hydrogeler är flera försiktighetsåtgärder nödvändiga för att säkerställa kvalitet mRNA utvinning på den enda koloninivå. Det är viktigt att optimera tiden jäst är i hydrogel kultur, för om jästen är kvar i kulturen för länge, många kommer att undkomma gränserna för hydrogeler, vilket leder till en högre bakgrundssignal under RNA sekvensering och lägre känslighet när diskriminerande mellan celltyper. Korrekt generering av spheroplasts med Zymolyase säkerställer att mRNA frigörs efter cellexponering för lysbuffert. Visuell inspektion av jäst kolonier efter Zymolyase bör ge glansigare jästceller. Felaktig cellväggsmätning leder till lägre RNA-avskiljningseffektivitet. Slutligen bör hydrogelerna vara tätt förpackade eftersom de matas in i enhet B. Övervakning av hydrogelingången med en höghastighetskamera gör det möjligt att avsluta emulsionsinsamlingen när hydrogelerna inte längre är tätt packade vid inmatning i enheten, annars kommer infångseffektiviteten att påverkas.
Ett potentiellt problem med vår metod är att microgel kultur jäst kan avsevärt förändra genuttryck. Tidigare arbete med att undersöka jästgenuttryck i microgels och på agar visar skillnader i genuttryck genomsnitt men totalt sett en positiv korrelation17, även om ytterligare undersökning av detta påstående om en mängd olika jäst stammar är försiktig. Metoden har också begränsad cellfångsteffektivitet på grund av stokastisk belastning av mRNA-fånga pärlor efter Poisson statistik14. För närvarande cirka 10% av dropparna innehåller en pärla och en koloni, och graden av dubbla inkapslingar förväntas vara under 1%. Dubbla inkapslingar leder till förvirrande element under RNA-seq dataanalys och deras filtrering är fortfarande utmanande23; en fångsthastighet på 25 % skulle leda till en motsvarande ökning av dubbla inkapslingar till 5 %(tilläggssiffra 2). Även om vi demonstrerar ICO-seq med hjälp av Drop-Seq-plattformen, finns det andra droplet RNA-seq plattformar som introducerar mRNA fånga pärlor deterministiskt snarare än statistiskt, såsom kommersiellt tillgängliga 10x Genomics Krom plattform15,24. Integrationen av dessa plattformar med ICO-seq skulle kunna öka fånga effektivitet utöver vad Poisson statistik tillåter. Slutligen är en grundläggande begränsning av droppen RNA-seq oförmåga att återvinna celler av intresse efter sekvensering. Denna begränsning bör beaktas när man överväger vilka typer av jäst bibliotek att analysera med denna metod.
Cell-till-cell heterogenitet har påvisats på klonnivå för mikrober som E. coli25 och S. cerevisiae26 avslöjar nya cellen påstår att en bulk-nivå analys annars skulle maskera. Bulk RNA-seq analyser som utförs på C. albicans tenderar att antingen titta på populationsomfattande transkriptom förändringar, eller vita och ogenomskinliga celler som två separata populationer27,28. Tillämpningen av ICO-seq kan leda till upptäckten av ytterligare delstater och ge en analytisk ram för att upptäcka nya celltillstånd inom andra jästarter. Emellertid, tillväxten av celler inom hydrogeler är inte begränsad till jäst: andra celltyper, såsom däggdjur, bakteriella, och andra svampceller kan också odlas inom hydrogels29,30. Sekvenseringen av isogen kolonier kontra enskilda celler leder till i genomsnitt av biologiskt buller på grund av cell-till-cell variation, förbättra diskriminering mellan celltyper. Detta kan hjälpa vid analys av celler där genetisk mångfald kretsar kring specifika syntesvägar. De utökade möjligheterna med celltyp ingång till ICO-seq och dess potentiella integration med kommersiellt tillgängliga droplet RNA-seq plattformar positioner ICO-seq som en lovande plattform för dissekering cellulär heterogenitet på genetisk nivå.
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt stöddes av National Science Foundation Career Award DBI-1253293, National Institutes of Health New Innovator Award DP2AR068129 och bevilja R01HG008978, National Science Foundation Technology Center grant DBI-1548297, och UCSF Center for Cellular Construction. ARA och ZJG är Chan-Zuckerberg Biohub Utredare.
0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | Used to make TE-TW buffer |
0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
1 mL syringes | BD | 309628 | |
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | Used to make TE-TW buffer |
27 gauge needles | BD | 305109 | |
3 mL syringes | BD | 309657 | |
3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | See Supplemental Files for 3D print file |
Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | a9414 | |
Aquapel (hydrophobic glass treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
Drop-Seq Beads | ChemGenes | MACOSKO-2011-10 | |
Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) | Corning | 294775X50 | |
Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref 14. Can substitute with PEG-PFPE surfactant. | ||
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Novec 7500 | 3M | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
PBS | Fisher Scientific | BP243820 | |
PE-2 polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
PEG-PFPE surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | See Supplemental Files for mask designs |
Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
SSC Buffer | Sigma-Aldrich | S6639 | |
SU-8 2100 | MicroChem | Y111075 | |
SU-8 2150 | MicroChem | Y111077 | |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Used to make TE-TW buffer |
YR Digestion buffer | Zymo Research | R1001-1 | Spheroplasting buffer |
YR Lysis Buffer | Zymo Research | R1001-2 | |
Zymolyase | Zymo Research | E1005 | Spheroplasting enzyme mixture |