मस्तिष्क झिल्ली प्रोटीन के Palmitoylation के मात्रात्मक निर्धारण के लिए Acyl-PEGyl एक्सचेंज जेल शिफ्ट परख
Summary
पलमिटोइलेशन में 16 कार्बन पामिटेट मोईटी को रिवर्सिबल तरीके से लक्षित प्रोटीन के अवशेषों को शामिल करने पर जोर दिया जाता है। यहां, हम माउस मस्तिष्क lysates में रुचि के किसी भी प्रोटीन के palmitoylation स्थिति की जांच करने के लिए, एक जैव रासायनिक दृष्टिकोण, acyl-PEGyl एक्सचेंज जेल शिफ्ट (APEGS) परख का वर्णन करते हैं ।
Abstract
पोस्टसिनैप्टिक घनत्व (पीएसडी) के भीतर सिनैप्टिक एम्पा रिसेप्टर्स (AMPARs) के स्तर में गतिविधि-निर्भर परिवर्तन सीखने और स्मृति के लिए एक सेलुलर तंत्र का प्रतिनिधित्व करने के लिए सोचा जाता है। पलमिटोइलेशन स्थानीयकरण और एम्पा-रुपये, सहायक कारकों और सिनैप्टिक मचान ों सहित कई सिनैप्टिक प्रोटीन के कार्य को गतिविधि-निर्भर तरीके से नियंत्रित करता है। हमने चार जीन (सिंडिजी 1-4) के सिनेप्स विभेदन प्रेरित जीन (सिंडिग) परिवार की पहचान की जो मस्तिष्क-विशिष्ट ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन को एन्कोडिंग करता है जो एम्प्रर्स के साथ संबद्ध होते हैं और सिनैप्स शक्ति को विनियमित करते हैं। सिंडिजी1 गतिविधि पर निर्भर उत्तेजक सिनेप्स विकास के लिए महत्वपूर्ण मुक़ाबला-ट्रांसझिल्ली क्षेत्र में 1 9 1 और 1 9 2 की स्थिति में स्थित दो साइटीन अवशेषों पर पामिटोयेटेड है। यहां, हम एक अभिनव जैव रासायनिक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं, acyl-PEGyl एक्सचेंज जेल शिफ्ट (APEGS) परख, ब्याज के किसी भी प्रोटीन के palmitoylation राज्य की जांच करने के लिए और माउस मस्तिष्क lysates में प्रोटीन के SynDIG परिवार के साथ अपनी उपयोगिता का प्रदर्शन ।
Introduction
एस-पालिटोइलेशन लक्ष्य प्रोटीन का एक रिवर्सिबल पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है जो स्थिर झिल्ली संघ, प्रोटीन तस्करी और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को नियंत्रित करता है1। इसमें पालिटोइल एसिलट्रांसफरेज (पैट) एंजाइमों द्वारा उत्प्रेरक थिओस्टर लिंकेज के माध्यम से साइटीन अवशेषों के लिए 16 कार्बन पामिटेट मोईटी शामिल है। मस्तिष्क में कई सिनैप्टिक प्रोटीन को पामोलिटोयेटेड किया जाता है, जिसमें एम्पा-आरएस और पीएसडी-95 शामिल हैं, स्थिरता, स्थानीयकरण और कार्य2,3,3,4को विनियमित करने के लिए गतिविधि-निर्भर तरीके से। पीएसडी में सिनैप्टिक एएमपीआर के स्तर में परिवर्तन पीएसडी-95 अंडरलिटसिटिक प्लास्टिसिटी जैसे सिनैप्टिक मचानके के साथ सहायक कारकों की बातचीत के माध्यम से; इस प्रकार, सिनैप्टिक प्रोटीन की पापिटोइलेशन स्थिति निर्धारित करने के तरीके सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी के तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।
इससे पहले, हमने चार जीन (SynDIG1-4) के सिंडिग परिवार की पहचान की जो मस्तिष्क-विशिष्ट ट्रांसम्मेब्रेन प्रोटीन को एन्कोडिंग करता है जो AMPARs5के साथ संबद्ध होता है। अतिअभिव्यक्ति या असंबद्ध चूहा हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स में SynDIG1 के नीचे क्रमशः बढ़ जाती है या कम हो जाती है, AMPA-R सिनैप्स आकार और संख्या ~ 50% के रूप में इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी5का उपयोग कर का पता चला। हमने यह प्रदर्शित करने के लिए acyl-biotin एक्सचेंज (ABE) परख का उपयोग किया कि सिंडिग्गी 1 स्थिरता, स्थानीयकरण और कार्य6को विनियमित करने के लिए एक गतिविधि-निर्भर तरीके से दो संरक्षित मुक़ाबला-ट्रांसमेम्ब्रेन सीस अवशेषों (सभी सिंडिग प्रोटीन में पाया जाता है) पर पामोलिटोयेटेड है। अबे परख संशोधन और बाद में आत्मीयता शुद्धि7द्वारा संरक्षित साइस्टीन पर बायोटिन के आदान- प्रदान पर निर्भर करता है । यहां, हम एक अभिनव जैव रासायनिक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं, acyl-PEGyl एक्सचेंज जेल शिफ्ट (APEGS) परख8,,9,,10,,11,,12,जो आत्मीयता शुद्धि की आवश्यकता नहीं है और इसके बजाय जेल गतिशीलता में परिवर्तन का उपयोग करता है ब्याज की एक प्रोटीन के लिए संशोधनों की संख्या निर्धारित करते हैं । प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क से एंडोजेनस झिल्ली प्रोटीन की जांच के लिए वर्णित है जिसके लिए उपयुक्त एंटीबॉडी उपलब्ध हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे पिछले काम में, हमने यह प्रदर्शित करने के लिए आबे परख का उपयोग किया कि SynDIG1 स्थिरता, स्थानीयकरण और कार्य6को विनियमित करने के लिए गतिविधि-निर्भर तरीके से दो संरक्षित मुक़ाबला-ट्रांसमेम्ब्र?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक एपेग्स परख पर सलाह और इनपुट के लिए के वूल्फ्रे का शुक्रिया अदा करते हैं। इन अध्ययनों को व्हाइटहॉल फाउंडेशन और एनआईएच-एनआईएम (1R01MH119347) से ईस्वी को अनुसंधान अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
Referências
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