Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Analisi per la Determinazione Quantitativa della Palmitoylation delle Proteine della Membrana Cerebrale
Summary
Palmitoylation comporta l’incorporazione di una moiety palmitativa 16-carbonio ai residui di cisteina delle proteine bersaglio in modo reversibile. Qui, descriviamo un approccio biochimico, l’analisi ApegS (acyl-PEGyl exchange gel shift), per studiare lo stato di palmitoylation di qualsiasi proteina di interesse nei lismi cerebrali dei topi.
Abstract
Si ritiene che le alterazioni dipendenti dall’attività nei livelli dei recettori sinaptici degli AMPA (AMPA) all’interno della densità post-sinaptica (PSD) rappresentino un meccanismo cellulare per l’apprendimento e la memoria. Palmitoylation regola la localizzazione e la funzione di molte proteine sinaptiche tra cui AMPA-R, fattori ausiliari e scaffold sinaptici in modo dipendente dall’attività. Abbiamo identificato la famiglia di geni indotti a differenziazione delle sinapsi (SynDIG) di quattro geni (SynDIG1-4) che codificano le proteine transmembrane specifiche del cervello che si associano agli AMPAR e regolano la forza della sinapsi. SynDIG1 è palmitoylated a due residui di cisteina situati nelle posizioni 191 e 192 nella regione juxta-transmembrane importante per lo sviluppo di sinapsi eccitatoria dipendenti dall’attività. Qui, descriviamo un approccio biochimico innovativo, l’analisi ApegS (acyl-PEGyl exchange gel shift), per studiare lo stato di palmitoylation di qualsiasi proteina di interesse e dimostrare la sua utilità con la famiglia SynDIG di proteine in lisato cerebrale del topo.
Introduction
S-palmitoylation è una modifica post-traduzionale reversibile delle proteine bersaglio che regola l’associazione stabile della membrana, il traffico di proteine e le interazioni proteina-proteina1. Si tratta dell’aggiunta di una moiety di palmitato di 16 carbonio ai residui di cisteina tramite il collegamento di tioester catalizzato da enzimi palmitoyl acyltransferasi (PAT). Molte proteine sinaptiche nel cervello sono palmitoylated, tra cui AMPA-Rs e PSD-95, in modo dipendente dall’attività per regolare la stabilità, localizzazione, e la funzione2,3,4. Alterazioni dei livelli di AMPAR sinaptici nel PSD attraverso l’interazione di fattori ausiliari con scaffold sinaptici come PSD-95 sono alla base della plasticità sinaptica; pertanto, i metodi per determinare lo stato di palmitoylation delle proteine sinaptiche forniscono importanti informazioni sui meccanismi della plasticità sinaptica.
In precedenza, abbiamo identificato la famiglia SynDIG di quattro geni (SynDIG1-4) che codificano proteine transmembrane specifiche del cervello che si associano agli AMPAR5. La sovraespressione o l’abbattimento di SynDIG1 nei neuroni ippocampali di ratto dissociati aumenta o diminuisce, rispettivamente, la dimensione e il numero della sinapsi AMPA-R del 50% come rilevato utilizzando l’immunocitochimica e l’elettrofisiologia5 . Abbiamo utilizzato il saggio Acyl-biotin exchange (ABE) per dimostrare che SynDIG1 è palmitoylated a due residui di Cis axta-transmembrana conservati (trovati in tutte le proteine SynDIG) in modo dipendente dall’attività per regolare la stabilità, la localizzazione e la funzione6. Il test ABE si basa sullo scambio di biotina su cistein protetti dalla modifica e dalla successiva purificazione dell’affinità7. Qui, descriviamo un approccio biochimico innovativo, il acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) assay8,9,10,11,12, che non richiede la purificazione dell’affinità e utilizza invece cambiamenti nella mobilità del gel per determinare il numero di modifiche per una proteina di interesse. Il protocollo è descritto per lo studio delle proteine della membrana endogena dal cervello del topo per il quale sono disponibili anticorpi adatti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel nostro lavoro precedente, abbiamo utilizzato il saggio ABE per dimostrare che SynDIG1 è palmitoylated a due residui di Cis axta-transmembrana conservati (che si trovano in tutte le proteine SynDIG) in modo dipendente dall’attività per regolare la stabilità, la localizzazione e la funzione6. Una limitazione è che l’analisi ABE richiede la purificazione dell’affinità con resine agarose coniugate alle moieties avidin e che come fase finale della procedura, con conseguente significativa perdi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano K. Woolfrey per consigli e contributi sul saggio APEGS. Questi studi sono stati finanziati da sovvenzioni di ricerca per l’EdS della Whitehall Foundation e del NIH-NIMH (1R01MH1119347).
Materials
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
Referências
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