Protokollet beskriver inställningarna och användningen av en kapillär aerosolgenerator för kontinuerlig produktion av kontrollerad aerosol från en flytande lösning av flera arter, lämplig för stadig aerosoltillförsel med stora volymer (t.ex. de vivo-inhalationsstudier).
Kapillär aerosolgenerator (CAG) drivs med principen om termisk vätskeavdunstning genom uppvärmning av e-vätska i den inledande fasen, följt av kärnbildning och kondens som regleras genom en blandning av luftflöde för att generera aerosoler, såsom i en elektronisk cigarett (EC). CAG är särskilt användbart för att generera aerosoler av stora volymer på ett kontinuerligt sätt, till exempel in vivo inhalationstoxikologiska studier, där användning av EG inte är möjlig. De termiska effekterna av att generera aerosol från CAG är likartade när det gäller temperatur som appliceras i en EG, vilket gör det möjligt för utredare att bedöma ångorna från e-vätskor i stor skala och reproducerbarhet. Eftersom driften av CAG tillåter användare att styra kritiska parametrar som flödeshastigheten för e-vätska, uppvärmningstemperaturer och utspädningsluftflöden, tillåter det utredare att testa olika e-vätskeformuleringar i en välkontrollerad enhet. Egenskaper, såsom aerosolpartikelstorlek, har visat sig regleras med luftflödeshastigheten med avseende på e-vätskeflödet och e-vätskekompositionen. CAG är dock begränsad när det gäller att bedöma vanliga EG-relaterade frågor, såsom överhettning av dess element. Vi försöker visa att CAG kan generera aerosol som är reproducerbar och kontinuerlig genom att bedöma de kemiska och fysikaliska aerosolegenskaperna med en vald e-vätskeformulering. Protokollet beskriver driftsparametrarna för vätskeflödeshastighet, utspädningsluftflöde och driftsprocedurer som behöver optimera aerosolkoncentrationen och partikelstorleken som krävs för en in vivo-toxikologisk studie. Genom att presentera de representativa resultaten från protokollet och diskutera utmaningarna och tillämpningarna av att arbeta med en CAG visar vi att CAG kan användas på ett reproducerbart sätt. Tekniken och protokollet, som har utvecklats från tidigare arbete, fungerar som en grund för framtida innovationer för laboratoriekontrollerade aerosolgenereringsundersökningar.
Vanliga e-vätskor innehåller en blandning av propylenglykol, glycerol, vatten, nikotin och utvalda smaker. Sammansättningen av en aerosol som genereras från en EC-anordning beror inte bara på vätskeformuleringen utan också på anordningens material, design och egenskaper. Följaktligen kan många EG-anordningar medföra en stor variation i aerosolutgången1, inklusive produktspecifik produktion av förhöjda halter av oönskade beståndsdelar, puffvolymvariation, förändring i luftflödet på grund av blockerade ventilationshål och “torr puffning” (när vätskebehållaren är nästan tom, vilket orsakar överhettning av anordningen eftersom en del av den levererade energin inte används för vätskeindunstning)2 . Dessutom skulle laddning, påfyllning och rengöring av EC-enheter under långsiktiga inhalationsstudier bli en enorm ytterligare begränsning när det gäller logistik3. Av dessa skäl bör andra aerosolgeneratorer övervägas för storskalig produktion av aerosoler och korrekt utvärdering av flytande formuleringar samtidigt som man undviker produktrelaterade variationer i aerosolsammansättningen och minskar arbetsbelastningen 4,5. Produktgenererade aerosoler bör dock förbli en del av riskbedömningsstrategierna, eftersom halterna av vissa beståndsdelar i EG-produkter kan vara högre än i laboratoriekontrollerade standardiserade aerosolgeneratorer på grund av produkternas värme-/kylspecificiteter 6,7,8.
På grund av den begränsade information om lagstadgade krav som för närvarande finns tillgänglig utvecklas fortfarande utvärderingsmetoderna för den potentiella toxiciteten hos aerosoler som genereras av elektroniska cigaretter (EC) 9,10,11. Noggrann in vitro– och in vivo-utvärdering kräver emellertid generering av väl karakteriserade och reproducerbara volymer aerosol över tiden. Att producera aerosol från en EG-enhet med en kontrollerad puffningsregim skulle säkert vara den mest representativa processen ur användarkonsumtionens perspektiv. När det gäller studier av lagstadgad toxicitet, med beaktande av en mängd olika möjliga flytande formuleringar som användarna ofta kan förbereda själva och samtidigt ändra vissa produktegenskaper (t.ex. levererad energi), är användningen av EG-produkter för att utföra toxikologiska studier med långvarig upprepad exponering inte bara utmanande utan också potentiellt otillräcklig.
Kapillär aerosolgenerator (CAG) – utvecklad av Philip Morris12,13 och ytterligare förfinad av Virginia Commonwealth University14 – arbetar med principen att skapa en stråle med varmt ångflöde från en elektriskt uppvärmd kapillär, som därefter kyls ner med omgivande luft, vilket orsakar partikelkärnbildning och efterföljande kondensation, vilket leder till aerosolbildning. Eftersom samma fysikaliska processer leder till aerosolbildning i EC (bortsett från leverans av vätskan till kapillären av en pump i CAG, som i en EG vanligtvis ersätts av kapillärkrafter som verkar på det transporterande materialet som drar vätskan från behållaren i EG), är egenskaperna hos CAG-genererade aerosoler mycket lika dem hos EG-aerosoler14 (Figur 1 ). CAG tillåter produktion av stora volymer aerosol, med få hanteringskrav; Den är därför särskilt lämplig för in vivo-inhalationsstudier.
CAG är en laboratorieanordning som består av ett uppvärmt kapillärrör som helt enkelt är anslutet till en temperaturregulator och till en vätskebehållare via en peristaltisk pump (figur 2A). Kapillären (160 mm, 21 G, rostfritt stål) värms upp av fyra värmeelement, alla inbäddade i ett aluminiumblock (figur 2B). Temperaturen är vanligtvis inställd på 250-275 ° C för att efterlikna spoluppvärmningsförhållandena för enEC-enhet 15. Vätskan som pumpas genom kapillären värms upp och förvandlas till varm ånga som kommer ut från kapillärens spets. CAG-enheten (figur 2C) kräver ytterligare element för att blanda den genererade ångan med kall luft och bilda en aerosol. Den plötsliga blandningen av den heta övermättade ångan med en kall luftström resulterar i kärnbildning och efterföljande kondensation, vilket leder till aerosolbildning (figur 2C). I vår CAG-design (figur 3) kyler ett ytterligare uppvärmt luftflöde först ner den yttre kroppen och cirkulerar därefter längs värmeblocken för att värma upp luftflödet, vilket samtidigt förhindrar kondens av vätskeflödet vid kapillärens spets och stabiliserar ångstrålen. Dessutom skapar det oönskad avskärmning av heta ångor, vilket påverkar kärnbildningsprocessen. Av denna anledning bör flödeshastigheten som appliceras för detta luftflöde vara minimal och passa syftet med applikationen. Detta luftflöde kommer att kallas “uppvärmt luftflöde” i hela detta manuskript, även om det måste förstås att denna ström värms passivt av värmeblocken och inte avsiktligt av användaren.
Kylluftflödeshastigheten har ett starkt inflytande på storleken på de genererade aerosolpartiklarna. Vid aerosolproduktion för de vivo-inhalationsstudier kommer utspädningsluftflödet att bestämma exponeringsdosen och kan behöva spädas ytterligare innan exponeringskammaren nårs. Förutom aerosolernas kemiska sammansättning är det viktigt att karakterisera aerosolpartikelstorleksfördelningen (PSD) för att säkerställa att den genererade aerosolen liknar den som genereras av ECs och inom det inhalationspartikelstorleksintervall som rekommenderas i OECD:s riktlinjer (ofta parametriserat genom antagandet om log-normalitet för PSD med aerodynamisk massmediandiameter [MMAD] och geometrisk standardavvikelse [GSD]).
MMAD för de genererade aerosolerna kan variera mycket beroende på enhetens design, fysikalisk-kemiska vätskeegenskaper hos formuleringen (t.ex. densitet, viskositet och ytspänning), luftflödeshastighet och temperatur som dikterar termodynamiska förhållanden 14,16,17. För in vivo-exponeringsexperiment består luftflödet i allmänhet av konditionerad, filtrerad luft vid 22 ± 2 °C och 60 % ± 5 % relativ luftfuktighet. Den genererade aerosolen kan sedan spädas ytterligare beroende på studiekraven för att uppnå målkoncentrationer i testatmosfären. Den levereras sedan via glasrör till exponeringskammaren för att minska filtreringsförlusten. I de resultat som presenteras här fastställs temperatur- och luftflödesinställningarna för att visa att CAG kan användas för kontinuerlig produktion av en kontrollerad aerosol med konsekvent och inandningsbar PSD och definierade koncentrationer för in vivo-inhalationsstudier.
I protokollet kommer vi att beskriva hur man: 1) montera CAG, 2) bestämma parametrar som krävs för att generera aerosol från CAG, 3) utföra aerosolgenerering och 4) analysera fysikaliska och kemiska beståndsdelar av intresse för aerosolen. För dessa preliminära körningar betraktar vi en flytande lösning baserad på en blandning av aerosolbildande komponenter: propylenglykol (PG), glycerol (VG), vatten och nikotin vid föreskrivna massfraktioner. Slutligen kommer vi att dela exempeldata för bedömning av en komplex blandning av flera arter som genereras i våra experiment (med ovan nämnda beståndsdelar blandade med ytterligare smakbeståndsdelar). Vi kommer att diskutera de övergripande resultaten och utmaningarna tillsammans med tillämpligheten av denna experimentella metod för bedömning av sådana blandningar.
Att generera aerosoler med CAG hjälper till att minska variationen i EC-enhetsspecifika aerosoliseringsprocesser, vilket möjliggör objektiv och kontrollerbar bedömning av själva aerosoliserad e-vätskeformulering. CAG-genererade aerosoler har visat sig vara representativa för de aerosoler som genereras av ECs7. De kan reproduceras med samma sammansättning och egenskaper och är därför särskilt lämpliga för in vivo långtidsexponeringsstudier som kräver stora volymer aerosol under en längre tidsperiod8.
CAG-installationen är relativt enkel att montera och lätt att underhålla. Driftsparametrarna, såsom vätskeflödeshastighet och respektive luftflödeshastigheter, är dock fortfarande kritiska för produktion av kontrollerad aerosol, vilket kräver metodoptimering enligt syftet med appliceringen av den CAG-genererade aerosolen.
Resultaten som presenteras i den aktuella studien visar att kylluftflödeshastigheten har en tydlig effekt på aerosolpartikelstorleksfördelningen. Kylluftflödet har en direkt inverkan inte bara på kärnbildningen av de genererade ångorna utan också på kondens på grund av kylningen av det inre slangen i vilket den genererade aerosolen flyter. Dessutom är den täta aerosolen benägen för betydande koagulationseffekter. Tillsammans är dessa processer komplexa och deras interaktion och inflytande på aerosolbildning är ganska svåra att generalisera för de specifika e-vätskorna, temperaturerna och flödena. Kompletterande luftflödeskomposition (torr eller fuktad med en fast procentandel relativ luftfuktighet) – i synnerhet vattenhalten – kommer att påverka värme och massutbyte, vilket leder till inte bara modulerad kondenstillväxt av aerosolpartiklar utan även väggkondensation. Således anses ändringar av denna metods parametrar vara för användningsändamål när det gäller att kontrollera PSD17,19.
Närvaron av kemikalier med låg löslighet eller höga kokpunkter kan begränsa effektiviteten hos CAG-genererad aerosol på grund av utfällning i kapillären och igensättning av kapillären över tiden. Beroende på de kemikalier som finns i aerosolen måste temperaturen för drift av CAG justeras för att generera ångan. Dessutom bör stabiliteten hos den flytande formuleringen regelbundet bedömas. Tillsats av beståndsdelar, inklusive smaker, med olika kokpunkter kommer att påverka den slutliga aerosolkompositionen14 och gas-vätskepartitionering. Det kan vara nödvändigt att anpassa kapillärtemperaturen och värmeluftflödet för att förhindra återflöde och vätskeavsättning nära den heta kapillären, vilket kan leda till generering av okontrollerade produkter med termisk nedbrytning (t.ex. karbonyler) på grund av den långa varaktigheten av kvarhållandet av vätskan vid en hög temperatur. Dessutom har styrning av temperaturen som används för att generera ångan i kapillären en inverkan på var ångan börjar bildas i kapillären – ju högre temperaturen desto tidigare bildas ångan. Med en högre kapillärtemperatur kommer ångan som kommer ut ur kapillären att ta längre tid att kylas ner av kylluftflödet och kommer därför att börja kärna och kondensera till en aerosol längre bort från kapillärspetsen, vilket hjälper till att undvika en återflödeseffekt19.
Nuvarande e-vätska in vivo toxikologiska studier är begränsade när det gäller att reproducera e-cigarettaerosoler på grund av den logistiska komplexiteten för att uppfylla den aerosolskala som krävs, såsom i en OECD TG 413-studie20. Protokollet som presenteras i denna studie ger en översikt över CAG-montering och inställningar som används vid Philip Morris International för aerosolgenerering i in vivo långtidsexponeringsstudier18. Dessa data kan fungera som en bra utgångspunkt för ytterligare finjustering i en annan laboratoriemiljö (t.ex. drug delivery-system21) eller för anpassning till specifika krav i en viss studie.
The authors have nothing to disclose.
Aluminium front cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Aluminium heating block, groove diameter 0.4mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | B-505432 | 2 x |
Aluminium rear cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
Cambridge glass filter pads | GE Healthcare UK Limited | 9703-9654 | 44 mm diameter |
Capillary 21 G SS, 160 mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | 304H21RW | 1 x |
Dry wipes | Contec Inc. , SC, USA | Prosat Wipes saturated with isopropyl alcohol | cleaning material |
Flowmeter | TSI, Shoreview, MI, USA | 4100 Series, 0-20 L/min | or equivalent |
Gilibrator-2 calibrator | Sensidyne, St-Petersburg FL, USA | Gilian Gilibrator-2 | Air flow calibrator |
Glass Couplings | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | |
Glass piping | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | Pipe 25 and 40 mm |
Heating elements | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | LDC01864 | 4 x |
High heat grease | Lubriplate Lubricant Company, NJ, USA | High temperature multipurpose grease | CAG maintenance |
Inner PEEK tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
Magnetic stirrer | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Germany | C-MAG HS 4 | or equivalent |
Micro impingers | Labo Service, Kontich, Belgium | Custom Built | |
Outer SS tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
PEEK adaptor | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Peristaltic pump | Watson-Marlow Fluid Technology Group, Falmouth, UK | Watson-Marlow 530 U | or equivalent |
Push-in fitting | Festo Pte Ltd | NPQM-DK-M5-Q4-P10 | 1 x |
Sample Column Extrelut NT3 cartridge | Merk Sigma-Aldrich | 115095 | |
SS 25 mm assembly cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
SS M8 lead screw | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
SS M8 nut | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
SS rear backing | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Temperature controller | Cole Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Digi-Sense TC 9600 | or equivalent |
Thermocouple type K | RS Components GmbH, Wädenswil, Switzerland | 814-0147 | 1 x |