Protokollen beskriver indstillingerne for og anvendelsen af en kapillær aerosolgenerator til kontinuerlig produktion af kontrolleret aerosol fra en væskeopløsning med flere arter, der er egnet til stabil aerosolafgivelse med store mængder (f.eks. de vivo-inhalationsundersøgelser).
Kapillæraerosolgeneratoren (CAG) drives med princippet om fordampning af termisk væske gennem opvarmning af e-væske i den indledende fase efterfulgt af nukleation og kondensering reguleret gennem en blanding af luftstrøm for at generere aerosoler, såsom i en elektronisk cigaret (EC). CAG’en er særlig nyttig til at generere aerosoler med store mængder på en kontinuerlig måde, f.eks. in vivo-inhalationstoksikologiske undersøgelser, hvor det ikke er muligt at anvende europæiske luft-stoffer. De termiske virkninger af at generere aerosol fra CAG’en er ens med hensyn til temperatur anvendt i en EF, hvilket gør det muligt for efterforskere at vurdere dampene fra e-væsker i skala og reproducerbarhed. Da driften af CAG’en giver brugerne mulighed for at kontrollere kritiske parametre såsom strømningshastigheden for e-væske, opvarmningstemperaturer og fortyndingsluftstrømme, giver det efterforskere mulighed for at teste forskellige e-væskeformuleringer i en velkontrolleret enhed. Egenskaber, såsom aerosolpartikelstørrelse, er påvist at være reguleret med luftstrømningshastigheden med hensyn til e-væskestrømmen og e-væskesammensætningen. CAG’en er imidlertid begrænset til at vurdere almindelige EF-relaterede spørgsmål, såsom overophedning af dens elementer. Vi søger at demonstrere, at CAG’en kan generere aerosol, der er reproducerbar og kontinuerlig, ved at vurdere de kemiske og fysiske aerosolegenskaber med en valgt e-flydende formulering. Protokollen beskriver driftsparametrene for væskestrømningshastighed, fortyndingsluftstrømningshastigheder og driftsprocedurer, der har brug for at optimere aerosolkoncentrationen og partikelstørrelsen, der kræves til en in vivo-toksikologiundersøgelse. Ved at præsentere de repræsentative resultater fra protokollen og diskutere udfordringerne og anvendelserne ved at arbejde med en CAG demonstrerer vi, at CAG kan bruges på en reproducerbar måde. Teknologien og protokollen, der er udviklet fra tidligere arbejde, tjener som grundlag for fremtidige innovationer til laboratoriestyrede aerosolgenereringsundersøgelser.
Almindelige e-væsker indeholder en blanding af propylenglycol, glycerol, vand, nikotin og udvalgte smagsstoffer. Sammensætningen af en aerosol genereret fra en EC-enhed afhænger ikke kun af den flydende formulering, men også af enhedens materiale, design og egenskaber. Følgelig kan mange EF-anordninger indføre en stor variation i aerosoludgang1, herunder enhedsspecifik produktion af forhøjede niveauer af uønskede bestanddele, variation i pustevolumen, ændring i luftstrømmen på grund af blokerede ventilationshuller og “tør pustning” (når væskebeholderen er næsten tom, hvilket forårsager overophedning af enheden, fordi en del af den leverede energi ikke anvendes til væskefordampning)2 . Desuden vil opladning, genopfyldning og rengøring af EF-udstyr under langsigtede indåndingsundersøgelser blive en enorm yderligere begrænsning med hensyn til logistik3. Af disse grunde bør andre aerosolgeneratorer overvejes til storstilet produktion af aerosoler og korrekt evaluering af flydende formuleringer, samtidig med at anordningsrelaterede variationer i aerosolsammensætningen undgås, og arbejdsbyrdenreduceres 4,5. Ikke desto mindre bør aerosoler, der genereres af udstyr, fortsat være en del af risikovurderingsstrategierne, fordi niveauerne af visse bestanddele i EF-udstyr kan være højere end i laboratoriestyrede standardiserede aerosolgeneratorer på grund af udstyrets særlige forholdved opvarmning/køling 6,7,8.
På grund af de begrænsede oplysninger om de lovgivningsmæssige krav, der i øjeblikket foreligger, udvikler evalueringsmetoderne for den potentielle toksicitet af aerosoler genereret af elektroniske cigaretter (EF) sig stadig 9,10,11. Nøjagtig in vitro- og in vivo-evaluering kræver imidlertid generering af velkarakteriturerede og reproducerbare mængder aerosol over tid. Fremstilling af aerosol fra en EF-enhed med et kontrolleret pusteregime ville helt sikkert være den mest repræsentative proces ud fra brugerforbrugets perspektiv. I forbindelse med undersøgelser af reguleringsmæssig toksicitet er anvendelsen af EF-udstyr til udførelse af langtidstoksicitetstoksikologiundersøgelser med gentagen eksponering ikke blot udfordrende, men også potentielt utilstrækkelig, idet der i forbindelse med en række mulige flydende formuleringer, som brugerne ofte selv kan forberede, og samtidig ændre visse udstyrsegenskaber (f.eks. leveret energi).
Kapillær aerosolgeneratoren (CAG) – udviklet af Philip Morris12,13 og yderligere raffineret af Virginia Commonwealth University14 – arbejder på princippet om at skabe en stråle af varm dampstrøm fra en elektrisk opvarmet kapillær, der efterfølgende afkøles med omgivende luft, hvilket forårsager partikelkernedannelse og efterfølgende kondensering, hvilket fører til aerosoldannelse. Fordi de samme fysiske processer fører til aerosoldannelse i EC’er (bortset fra tilførsel af væsken til kapillæren ved hjælp af en pumpe i CAG’en, som i en EC normalt erstattes af kapillærkræfter, der virker på det transporterende materiale, der trækker væsken fra reservoiret i EF), er egenskaberne ved CAG-genererede aerosoler meget lig dem for EC-aerosoler14 (figur 1 ). CAG’en tillader produktion af store mængder aerosol med få håndteringskrav; det er derfor særligt velegnet til de vivo-inhalationsundersøgelser.
CAG’en er en laboratorieanordning bestående af et opvarmet kapillarrør, der simpelthen er forbundet til en temperaturregulator og til et flydende reservoir via en peristaltisk pumpe (figur 2A). Kapillæren (160 mm, 21 G, rustfrit stål) opvarmes af fire varmeelementer, alle indlejret i en aluminiumsblok (figur 2B). Temperaturen indstilles typisk til 250-275 °C for at efterligne spoleopvarmningsforholdene for en EC-enhed15. Væsken, der pumpes gennem kapillæren, opvarmes og omdannes til varm damp, der kommer ud af kapillærens spids. CAG-samlingen (figur 2C) kræver yderligere elementer til blanding af den genererede damp med kold luft og dannelse af en aerosol. Den pludselige blanding af den varme overmættede damp med en kold luftstrøm resulterer i nukleation og efterfølgende kondensering, hvilket fører til aerosoldannelse (figur 2C). I vores CAG-design (figur 3) køler en yderligere opvarmet luftstrøm først det ydre legeme ned og cirkulerer derefter langs varmeblokkene for at opvarme luftstrømmen, hvilket samtidig forhindrer kondensering af væsketilstrømningen ved spidsen af kapillæren og stabiliserer dampstråleudbruddet. Derudover skaber det uønsket afskærmning af varme dampe, hvilket påvirker nukleationsprocessen. Af denne grund skal den strømningshastighed, der anvendes til denne luftstrøm, være minimal og passe til formålet med applikationen. Denne luftstrøm vil blive kaldt “opvarmet luftstrøm” i hele dette manuskript, selvom det skal forstås, at denne strøm opvarmes passivt af varmeblokkene og ikke med vilje af brugeren.
Køleluftstrømningshastigheden har en stærk indflydelse på størrelsen af de genererede aerosolpartikler. I aerosolproduktion til de vivo-inhalationsundersøgelser bestemmer fortyndingsluftstrømmen eksponeringsdosis og skal muligvis fortyndes yderligere, før eksponeringskammeret nås. Ud over aerosolernes kemiske sammensætning er det vigtigt at karakterisere aerosolpartikelstørrelsesfordelingen (PSD) for at sikre, at den genererede aerosol svarer til den, der genereres af EC’er og inden for det inhalationspartikelstørrelsesområde, der anbefales i OECD’s retningslinjer (ofte parameteriseret ved antagelse af log-normalitet af PSD med massemedian aerodynamisk diameter [MMAD] og geometrisk standardafvigelse [GSD]).
MMAD for de genererede aerosoler kan variere meget afhængigt af enhedens design, formuleringens fysisk-kemiske væskeegenskaber (f.eks. Densitet, viskositet og overfladespænding), luftstrømningshastighed og temperatur, der dikterer termodynamiske forhold 14,16,17. For in vivo-eksponeringsforsøg består luftstrømmen generelt af konditioneret, filtreret luft ved 22 ± 2 °C og 60 % ± 5 % relativ luftfugtighed. Den genererede aerosol kan derefter fortyndes yderligere afhængigt af undersøgelseskravene for at opnå målkoncentrationer i testatmosfæren. Det leveres derefter via glasrør til eksponeringskammeret for at mindske filtreringstabet. I de resultater, der præsenteres her, er temperatur- og luftstrømsindstillingerne fastlagt for at påvise, at CAG’en kan anvendes til kontinuerlig produktion af en kontrolleret aerosol med konsistent og inhalerbar PSD og definerede koncentrationer til in vivo-inhalationsundersøgelser.
I protokollen beskriver vi, hvordan man: 1) samler CAG’en, 2) bestemmer parametre, der kræves for at generere aerosol fra CAG’en, 3) udfører aerosolgenerering og 4) analyserer fysiske og kemiske bestanddele af interesse for aerosolen. Til disse indledende kørsler overvejer vi en flydende opløsning baseret på en blanding af aerosoldannende komponenter: propylenglycol (PG), glycerol (VG), vand og nikotin ved foreskrevne massefraktioner. Endelig vil vi dele eksempeldata til vurdering af en kompleks blanding af flere arter, der genereres i vores eksperimenter (med de ovennævnte bestanddele blandet med yderligere smagsbestanddele). Vi vil diskutere de overordnede resultater og udfordringer sammen med anvendeligheden af denne eksperimentelle tilgang til vurdering af sådanne blandinger.
Generering af aerosoler med CAG hjælper med at reducere variabiliteten af EC-enhedsspecifikke aerosoliseringsprocesser, hvilket muliggør objektiv og kontrollerbar vurdering af selve den aerosoliserede e-væskeformulering. CAG-genererede aerosoler har vist sig at være repræsentative for de aerosoler, der genereres af ECs7. De kan reproduceres med samme sammensætning og egenskaber og er derfor særligt velegnede til in vivo-undersøgelser af langvarig eksponering, der kræver store mængder aerosol over en længere periode8.
CAG-opsætningen er relativt enkel at samle og nem at vedligeholde. Driftsparametrene, såsom væskestrømningshastighed og respektive luftstrømningshastigheder, forbliver imidlertid kritiske for produktion af kontrolleret aerosol, hvilket kræver metodeoptimering i henhold til formålet med anvendelsen af den CAG-genererede aerosol.
Resultaterne i den aktuelle undersøgelse viser, at køleluftstrømningshastighed har en klar effekt på aerosolpartikelstørrelsesfordelingen. Køleluftstrømmen har en direkte indvirkning ikke kun på kernen af de genererede dampe, men også på kondens på grund af afkøling af det indre rør, hvori den genererede aerosol strømmer. Derudover er den tætte aerosol tilbøjelig til betydelige koagulationseffekter. Kombineret er disse processer komplekse, og deres interaktion og indflydelse på aerosoldannelse er ret vanskelige at generalisere for de specifikke e-væsker, temperaturer og strømme. Supplerende luftstrømssammensætning (tør eller befugtet med en fast procentdel af relativ luftfugtighed) – især vandindholdet – vil påvirke varme- og masseudvekslingen, hvilket ikke kun fører til moduleret kondensationsvækst af aerosolpartikler, men også vægkondensation. Ændringer af denne metodes parametre anses således for at være anvendt med henblik på at kontrollere PSD17,19.
Tilstedeværelsen af kemikalier med lav opløselighed eller høje kogepunkter kan begrænse effektiviteten af CAG-genereret aerosol på grund af udfældning i kapillæren og tilstopning af kapillæren over tid. Afhængigt af de kemikalier, der er til stede i aerosolen, skal temperaturen til drift af CAG’en justeres for at generere dampen. Desuden bør stabiliteten af den flydende formulering vurderes regelmæssigt. Tilsætning af bestanddele, herunder smagsstoffer, med forskellige kogepunkter vil have indflydelse på den endelige aerosolsammensætning14 og gas-væske-opdeling. Det kan være nødvendigt at tilpasse kapillærtemperaturen og opvarmningsluftstrømmen for at forhindre tilbagestrømning og væskeaflejring nær den varme kapillær, hvilket kan resultere i generering af ukontrollerede produkter med termisk nedbrydning (såsom carbonyler) på grund af den lange varighed af tilbageholdelse af væsken ved en høj temperatur. Derudover har styring af temperaturen, der bruges til at generere dampen i kapillæren, indflydelse på, hvor dampen begynder at danne sig i kapillæren – jo højere temperaturen er, jo tidligere dannes dampen. Med en højere kapillærtemperatur vil dampen, der kommer ud af kapillæren, tage længere tid at blive afkølet af køleluftstrømmen og vil derfor begynde at nukleere og kondensere til en aerosol længere væk fra kapillærspidsen, hvilket hjælper med at undgå en tilbagestrømningseffekt19.
Nuværende in vivo-toksikologiske undersøgelser af e-væske er begrænsede til at reproducere e-cigaretaerosoler på grund af den logistiske kompleksitet for at opfylde omfanget af aerosol, der kræves, f.eks. i en OECD TG 413-undersøgelse20. Protokollen, der præsenteres i denne undersøgelse, giver et overblik over CAG-samlingen og de indstillinger, der anvendes på Philip Morris International til aerosolgenerering in vivo-langtidseksponeringsundersøgelser 18. Disse data kan tjene som et godt udgangspunkt for yderligere finjustering i et andet laboratoriemiljø (f.eks. lægemiddelafgivelsessystemer21) eller for tilpasning til specifikke krav i en bestemt undersøgelse.
The authors have nothing to disclose.
Aluminium front cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Aluminium heating block, groove diameter 0.4mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | B-505432 | 2 x |
Aluminium rear cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
Cambridge glass filter pads | GE Healthcare UK Limited | 9703-9654 | 44 mm diameter |
Capillary 21 G SS, 160 mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | 304H21RW | 1 x |
Dry wipes | Contec Inc. , SC, USA | Prosat Wipes saturated with isopropyl alcohol | cleaning material |
Flowmeter | TSI, Shoreview, MI, USA | 4100 Series, 0-20 L/min | or equivalent |
Gilibrator-2 calibrator | Sensidyne, St-Petersburg FL, USA | Gilian Gilibrator-2 | Air flow calibrator |
Glass Couplings | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | |
Glass piping | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | Pipe 25 and 40 mm |
Heating elements | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | LDC01864 | 4 x |
High heat grease | Lubriplate Lubricant Company, NJ, USA | High temperature multipurpose grease | CAG maintenance |
Inner PEEK tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
Magnetic stirrer | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Germany | C-MAG HS 4 | or equivalent |
Micro impingers | Labo Service, Kontich, Belgium | Custom Built | |
Outer SS tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
PEEK adaptor | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Peristaltic pump | Watson-Marlow Fluid Technology Group, Falmouth, UK | Watson-Marlow 530 U | or equivalent |
Push-in fitting | Festo Pte Ltd | NPQM-DK-M5-Q4-P10 | 1 x |
Sample Column Extrelut NT3 cartridge | Merk Sigma-Aldrich | 115095 | |
SS 25 mm assembly cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
SS M8 lead screw | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
SS M8 nut | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
SS rear backing | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Temperature controller | Cole Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Digi-Sense TC 9600 | or equivalent |
Thermocouple type K | RS Components GmbH, Wädenswil, Switzerland | 814-0147 | 1 x |