Het protocol beschrijft de instellingen en het gebruik van een capillaire aerosolgenerator voor continue productie van gecontroleerde aerosol uit een vloeistofoplossing met meerdere soorten, geschikt voor een stabiele aerosolafgifte met groot volume (bijv. in vivo inhalatiestudies).
De capillaire aerosolgenerator (CAG) wordt bediend met het principe van thermische vloeistofverdamping door verhitting van e-vloeistof in de beginfase, gevolgd door nucleatie en condensatie gereguleerd door een mengsel van luchtstroom om aerosolen te genereren, zoals in een elektronische sigaret (EC). De CAG is bijzonder nuttig bij het continu genereren van aerosolen van grote volumes, bijvoorbeeld in vivo inhalatietoxicologiestudies, waarbij het gebruik van EC’s niet haalbaar is. De thermische effecten van het genereren van aerosol uit de CAG zijn vergelijkbaar in termen van temperatuur toegepast in een EC, waardoor onderzoekers de dampen van e-liquids op schaal en reproduceerbaarheid kunnen beoordelen. Omdat de werking van de CAG gebruikers in staat stelt om kritieke parameters zoals het debiet van e-vloeistof, verwarmingstemperaturen en verdunningsluchtstromen te regelen, kunnen onderzoekers verschillende e-vloeistofformuleringen testen in een goed gecontroleerd apparaat. Eigenschappen, zoals aerosoldeeltjesgrootte, zijn aangetoond te worden geregeld met het luchtdebiet met betrekking tot de e-vloeistofstroom en e-vloeistofsamenstelling. De CAG is echter beperkt in het beoordelen van veelvoorkomende EG-gerelateerde kwesties, zoals oververhitting van de elementen ervan. We proberen aan te tonen dat de CAG aerosol kan genereren die reproduceerbaar en continu is, door de chemische en fysische aerosolkenmerken te beoordelen met een gekozen e-liquidformulering. Het protocol beschrijft de bedrijfsparameters van vloeistofdebiet, verdunningsluchtstroomsnelheden en bedrijfsprocedures die nodig zijn om de aerosolconcentratie en deeltjesgrootte te optimaliseren die nodig zijn voor een in vivo toxicologisch onderzoek. Door de representatieve resultaten uit het protocol te presenteren en de uitdagingen en toepassingen van het werken met een CAG te bespreken, laten we zien dat CAG op een reproduceerbare manier kan worden gebruikt. De technologie en het protocol, dat is ontwikkeld op basis van eerder werk, dienen als basis voor toekomstige innovaties voor laboratoriumgestuurde aerosolgeneratieonderzoeken.
Gewone e-liquids bevatten een mengsel van propyleenglycol, glycerol, water, nicotine en geselecteerde smaken. De samenstelling van een aerosol die wordt gegenereerd door een EC-apparaat hangt niet alleen af van de vloeibare formulering, maar ook van het materiaal, het ontwerp en de kenmerken van het apparaat. Bijgevolg kunnen veel EC-apparaten een grote variabiliteit in aerosoloutput1 introduceren, waaronder apparaatspecifieke productie van verhoogde niveaus van ongewenste bestanddelen, variatie in pufvolume, verandering in luchtstroom als gevolg van geblokkeerde ventilatiegaten en “droog puffen” (wanneer de vloeistofcontainer bijna leeg is, waardoor het apparaat oververhit raakt omdat een deel van de geleverde energie niet wordt gebruikt voor vloeistofverdamping)2 . Bovendien zou het opladen, bijvullen en reinigen van EC-apparaten tijdens langdurige inhalatiestudies een enorme extra beperking worden in termen van logistiek3. Om deze redenen moeten andere aerosolgeneratoren worden overwogen voor grootschalige productie van aerosolen en een goede evaluatie van vloeibare formuleringen, waarbij apparaatgerelateerde variaties in aerosolsamenstelling worden vermeden en de werklast wordt verminderd 4,5. Niettemin moeten door apparaten gegenereerde aerosolen deel blijven uitmaken van risicobeoordelingsstrategieën, omdat de niveaus van bepaalde bestanddelen in EG-hulpmiddelen hoger kunnen zijn dan die in laboratoriumgestuurde gestandaardiseerde aerosolgeneratoren als gevolg van de specifieke kenmerken van de apparaten voor verwarming/koeling 6,7,8.
Vanwege de beperkte informatie over wettelijke vereisten die momenteel beschikbaar is, evolueren de evaluatiemethoden voor de potentiële toxiciteit van aerosolen die door elektronische sigaretten worden gegenereerd (EC) nog steeds 9,10,11. Nauwkeurige in vitro pt in vivo evaluatie vereist echter het genereren van goed gekarakteriseerde en reproduceerbare volumes aerosol in de loop van de tijd. Het produceren van aerosol uit een EG-apparaat met een gecontroleerd pufregime zou zeker het meest representatieve proces zijn vanuit het oogpunt van gebruikersconsumptie. Voor toxiciteitsstudies in de regelgeving, rekening houdend met een verscheidenheid aan mogelijke vloeibare formuleringen die gebruikers vaak zelf kunnen bereiden en tegelijkertijd bepaalde kenmerken van het hulpmiddel (bijv. geleverde energie) wijzigen, is het gebruik van EC-hulpmiddelen voor het uitvoeren van toxicologische studies bij herhaalde blootstelling op lange termijn niet alleen een uitdaging, maar ook potentieel ontoereikend.
De capillaire aerosolgenerator (CAG) – ontwikkeld door Philip Morris 12,13 en verder verfijnd door Virginia Commonwealth University14 – werkt volgens het principe van het creëren van een straal hete dampstroom uit een elektrisch verwarmd capillair, dat vervolgens wordt afgekoeld met omgevingslucht, waardoor deeltjeskernvorming en daaropvolgende condensatie ontstaan, wat leidt tot aerosolvorming. Omdat dezelfde fysische processen leiden tot aerosolvorming in EC’s (afgezien van de afgifte van de vloeistof aan het capillair door een pomp in de CAG, die in een EC meestal wordt vervangen door capillaire krachten die inwerken op het vochtafvoerende materiaal dat de vloeistof uit het reservoir in de EC trekt), zijn de kenmerken van CAG-gegenereerde aerosolen zeer vergelijkbaar met die van EC-aerosolen14 (figuur 1 ). De CAG maakt de productie van grote hoeveelheden aerosol mogelijk, met weinig behandelingsvereisten; het is daarom bijzonder geschikt voor in vivo inhalatiestudies.
De CAG is een laboratoriumapparaat dat bestaat uit een verwarmde capillaire buis die eenvoudig is aangesloten op een temperatuurregelaar en via een peristaltische pomp op een vloeistofreservoir (figuur 2A). Het capillair (160 mm, 21 G, roestvrij staal) wordt verwarmd door vier verwarmingselementen, allemaal ingebed in een aluminium blok (figuur 2B). De temperatuur wordt meestal ingesteld op 250-275 °C om de spoelverwarmingsomstandigheden van een EC-apparaat na te bootsen15. De vloeistof die door het capillair wordt gepompt, wordt opgewarmd en omgezet in hete damp die uit de punt van het capillair komt. De CAG-assemblage (figuur 2C) vereist extra elementen voor het mengen van de gegenereerde damp met koude lucht en het vormen van een aerosol. Het abrupt mengen van de hete oververzadigde damp met een koude luchtstroom resulteert in nucleatie en daaropvolgende condensatie, wat leidt tot aerosolvorming (figuur 2C). In ons CAG-ontwerp (figuur 3) koelt een extra verwarmde luchtstroom eerst het externe lichaam af en circuleert vervolgens langs de verwarmingsblokken om de luchtstroom op te warmen, waardoor tegelijkertijd condensatie van de vloeistofterugstroom aan de punt van het capillair wordt voorkomen en de dampstraaluitbarsting wordt gestabiliseerd. Bovendien creëert het ongewenste afscherming van hete dampen, waardoor het nucleatieproces wordt beïnvloed. Om deze reden moet het debiet dat voor deze luchtstroom wordt toegepast minimaal zijn en passen bij het doel van de toepassing. Deze luchtstroom zal in dit manuscript “verwarmde luchtstroom” worden genoemd, hoewel het duidelijk moet zijn dat deze stroom passief wordt verwarmd door de verwarmingsblokken en niet opzettelijk door de gebruiker.
Het koelluchtdebiet heeft een sterke invloed op de grootte van de gegenereerde aerosoldeeltjes. Bij aerosolproductie voor in vivo inhalatiestudies zal de verdunningsluchtstroom de blootstellingsdosis bepalen en mogelijk verder moeten worden verdund voordat de blootstellingskamer wordt bereikt. Naast de chemische samenstelling van aerosolen, is het essentieel om aerosol deeltjesgrootteverdeling (PSD) te karakteriseren om ervoor te zorgen dat de gegenereerde aerosol vergelijkbaar is met die gegenereerd door EC’s en binnen het inhalatiedeeltjesgroottebereik aanbevolen door de OESO-richtlijnen (vaak geparametriseerd door de aanname van log-normaliteit van PSD met massamediane aerodynamische diameter [MMAD] en geometrische standaardafwijking [GSD]).
De MMAD van de gegenereerde aerosolen kan sterk variëren, afhankelijk van het ontwerp van het apparaat, de fysisch-chemische vloeistofeigenschappen van de formulering (bijv. dichtheid, viscositeit en oppervlaktespanning), luchtdebiet en temperatuur die thermodynamische omstandigheden dicteren 14,16,17. Voor in vivo blootstellingsexperimenten bestaat de luchtstroom over het algemeen uit geconditioneerde, gefilterde lucht bij 22 ± 2 °C en 60% ± 5% relatieve vochtigheid. De gegenereerde aerosol kan vervolgens verder worden verdund, afhankelijk van de onderzoeksvereisten, om doelconcentraties in de testatmosfeer te bereiken. Het wordt vervolgens via glazen leidingen naar de blootstellingskamer gebracht om filtratieverlies te verminderen. In de hier gepresenteerde resultaten worden de temperatuur- en luchtstroominstellingen vastgesteld om aan te tonen dat de CAG kan worden gebruikt voor continue productie van een gecontroleerde aerosol met consistente en inhaleerbare PSD en gedefinieerde concentraties voor in vivo inhalatiestudies.
In het protocol zullen we beschrijven hoe: 1) de CAG te assembleren, 2) parameters te bepalen die nodig zijn om aerosol uit de CAG te genereren, 3) aerosolgeneratie uit te voeren en 4) fysische en chemische bestanddelen van belang in de aerosol te analyseren. Voor deze voorbereidende runs overwegen we een vloeibare oplossing op basis van een mengsel van aerosolvormende componenten: propyleenglycol (PG), glycerol (VG), water en nicotine bij voorgeschreven massafracties. Ten slotte zullen we voorbeeldgegevens delen voor de beoordeling van een complex multispecies-mengsel dat in onze experimenten is gegenereerd (waarbij de bovengenoemde bestanddelen gemengd met extra smaakbestanddelen betrokken zijn). We zullen de algemene resultaten en uitdagingen bespreken, samen met de toepasbaarheid van deze experimentele aanpak voor de beoordeling van dergelijke mengsels.
Het genereren van aerosolen met CAG helpt de variabiliteit van EC-apparaatspecifieke aerosolisatieprocessen te verminderen, waardoor een objectieve en controleerbare beoordeling van de aerosolized e-liquid-formulering zelf mogelijk is. Cag-gegenereerde aerosolen zijn representatief gebleken voor de aerosolen die worden gegenereerd door EC’s7. Ze kunnen reproduceerbaar worden gegenereerd met dezelfde samenstelling en kenmerken en zijn daarom bijzonder geschikt voor in vivo langetermijnblootstellingsstudies die grote hoeveelheden aerosol gedurende een lange periode vereisen8.
De CAG-opstelling is relatief eenvoudig te monteren en te onderhouden. De bedrijfsparameters, zoals het vloeistofdebiet en de respectieve luchtdebieten, blijven echter van cruciaal belang voor de productie van gecontroleerde aerosol, wat methode-optimalisatie vereist op basis van het doel van de toepassing van de door CAG gegenereerde aerosol.
De resultaten die in de huidige studie worden gepresenteerd, tonen aan dat het koelluchtdebiet een duidelijk effect heeft op de deeltjesgrootteverdeling van aerosolen. De koelluchtstroom heeft niet alleen een directe invloed op de nucleatie van de gegenereerde dampen, maar ook op condensatie, vanwege de koeling van de interne buizen waarin de gegenereerde aerosol stroomt. Bovendien is de dichte aerosol gevoelig voor aanzienlijke stollingseffecten. Gecombineerd zijn deze processen complex en hun interactie en invloed op aerosolvorming zijn vrij moeilijk te generaliseren voor de specifieke e-liquids, temperaturen en stromen. Aanvullende luchtstroomsamenstelling (droog of bevochtigd met een vast percentage relatieve vochtigheid) – in het bijzonder het watergehalte – zal de warmte- en massa-uitwisseling beïnvloeden, wat niet alleen leidt tot gemoduleerde condensatiegroei van aerosoldeeltjes, maar ook tot wandcondensatie. Wijzigingen in de parameters van deze methode worden dus geacht te worden gebruikt voor het beheersen van de PSD17,19.
De aanwezigheid van chemicaliën met een lage oplosbaarheid of hoge kookpunten kan de effectiviteit van cag-gegenereerde aerosol beperken als gevolg van neerslag in het capillair en verstopping van het capillair in de loop van de tijd. Afhankelijk van de chemicaliën die in de aerosol aanwezig zijn, moet de temperatuur voor het bedienen van de CAG worden aangepast om de damp te genereren. Bovendien moet de stabiliteit van de vloeibare formulering regelmatig worden beoordeeld. Toevoeging van bestanddelen, inclusief smaken, met verschillende kookpunten zal een invloed hebben op de uiteindelijke aerosolsamenstelling14 en gas-vloeistofverdeling. Het kan nodig zijn om de capillaire temperatuur en de verwarmingsluchtstroom aan te passen om terugstroming en vloeistofafzetting in de buurt van het hete capillair te voorkomen, wat kan leiden tot het genereren van ongecontroleerde producten van thermische degradatie (zoals carbonylen) vanwege de lange duur van het vasthouden van de vloeistof bij een hoge temperatuur. Bovendien heeft het regelen van de temperatuur die wordt gebruikt om de damp in het capillair te genereren invloed op waar de damp zich in het capillair begint te vormen – hoe hoger de temperatuur, hoe eerder de damp wordt gevormd. Bij een hogere capillaire temperatuur zal de damp die uit het capillair komt langer nodig hebben om te worden afgekoeld door de koelluchtstroom en zal daarom beginnen te nucleeren en condenseren tot een aerosol verder weg van de capillaire punt, waardoor een terugstroomeffect wordt voorkomen19.
De huidige e-liquid in vivo toxicologische studies zijn beperkt in het reproduceren van e-sigaretaërosolen vanwege de logistieke complexiteit om te voldoen aan de schaal van aerosol die vereist is, zoals in een OESO TG 413-studie20. Het protocol dat in deze studie wordt gepresenteerd, geeft een overzicht van de CAG-assemblage en -instellingen die bij Philip Morris International worden gebruikt voor aerosolgeneratie in in vivo langetermijnblootstellingsstudies18. Deze gegevens kunnen dienen als een goed uitgangspunt voor verdere afstemming in een andere laboratoriumomgeving (bijv. medicijnafgiftesystemen21) of voor aanpassing aan specifieke vereisten van een bepaald onderzoek.
The authors have nothing to disclose.
Aluminium front cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Aluminium heating block, groove diameter 0.4mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | B-505432 | 2 x |
Aluminium rear cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
Cambridge glass filter pads | GE Healthcare UK Limited | 9703-9654 | 44 mm diameter |
Capillary 21 G SS, 160 mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | 304H21RW | 1 x |
Dry wipes | Contec Inc. , SC, USA | Prosat Wipes saturated with isopropyl alcohol | cleaning material |
Flowmeter | TSI, Shoreview, MI, USA | 4100 Series, 0-20 L/min | or equivalent |
Gilibrator-2 calibrator | Sensidyne, St-Petersburg FL, USA | Gilian Gilibrator-2 | Air flow calibrator |
Glass Couplings | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | |
Glass piping | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | Pipe 25 and 40 mm |
Heating elements | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | LDC01864 | 4 x |
High heat grease | Lubriplate Lubricant Company, NJ, USA | High temperature multipurpose grease | CAG maintenance |
Inner PEEK tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
Magnetic stirrer | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Germany | C-MAG HS 4 | or equivalent |
Micro impingers | Labo Service, Kontich, Belgium | Custom Built | |
Outer SS tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
PEEK adaptor | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Peristaltic pump | Watson-Marlow Fluid Technology Group, Falmouth, UK | Watson-Marlow 530 U | or equivalent |
Push-in fitting | Festo Pte Ltd | NPQM-DK-M5-Q4-P10 | 1 x |
Sample Column Extrelut NT3 cartridge | Merk Sigma-Aldrich | 115095 | |
SS 25 mm assembly cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
SS M8 lead screw | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
SS M8 nut | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
SS rear backing | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Temperature controller | Cole Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Digi-Sense TC 9600 | or equivalent |
Thermocouple type K | RS Components GmbH, Wädenswil, Switzerland | 814-0147 | 1 x |