तिलपिया झील वायरस के विशिष्ट और तेजी से पता लगाने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (आरटी-लैंप) परख
Summary
हम पारंपरिक आरटी-पीसीआर तकनीकों की तुलना में अपेक्षाकृत कम समय में सरल उपकरणों का उपयोग करके तिलपिया मछली में TiLV का पता लगाने के लिए एक आरटी-लैंप परख पेश करते हैं। यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से विकासशील देशों में TiLVD के महामारी प्रसार को नियंत्रित करने में मदद कर सकता है ।
Abstract
तिलपिया झील वायरस रोग (TiLVD), तिलपिया झील वायरस (TiLV) की वजह से तिलपिया में एक उभरती हुई वायरल बीमारी, जलकृषि उद्योग में एक निरंतर चुनौती है जिसके परिणामस्वरूप दुनिया के कई हिस्सों में तिलपिया की सामूहिक रुग्णता और मृत्यु हो गई है । इसलिए प्रारंभिक संक्रमण का पता लगाने और जलकृषि खेती में रोग के प्रसार को रोकने के लिए TiLV संक्रमण के लिए एक प्रभावी, तेजी से और सटीक नैदानिक परख आवश्यक है। इस अध्ययन में, मछली के ऊतकों में तिलपिया झील वायरस का पता लगाने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील और व्यावहारिक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (आरटी-लैंप) विधि प्रस्तुत की गई है। संक्रमित नमूनों के आरटी-क्यूपीसीआर और आरटी-लैंप परखों की तुलना में 63 (100%) और 51 (80.95%) नमूने, क्रमशः। इसके अलावा, असंक्रमित नमूनों के विश्लेषण से पता चला है कि सभी ६३ असंक्रमित ऊतकों ने आरटी-क्यूपीसीआर और आरटी-लैंप परख दोनों के लिए नकारात्मक परिणाम दिए । तिलपिया में पांच रोगजनकों के साथ क्रॉस-रिएक्टिविटी का मूल्यांकन आरटी-लैंप का उपयोग करके किया गया था, और सभी परीक्षणों ने नकारात्मक परिणाम दिखाए। दोनों जिगर और बलगम संक्रमित मछली से प्राप्त नमूनों आरटी-लैंप विधि का उपयोग कर तुलनीय परिणाम दिखाया, सुझाव है कि बलगम एक गैर घातक परख के रूप में आरटी-दीपक में इस्तेमाल किया जा सकता है मछली की हत्या से बचने के लिए । निष्कर्ष में, परिणामों ने दिखाया कि प्रस्तुत आरटी-लैंप परख 1 घंटे के भीतर तिलपिया ऊतक में TiLV का पता लगाने के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है। इसलिए TiLV के तेजी से निदान के लिए खेतों पर एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में विधि की सिफारिश की है।
Introduction
तिलपिया झील वायरस रोग (TiLVD) तिलपिया(Oreochromis spp.) में एक वायरल बीमारी है जो कथित तौर पर एशिया1,2,2अफ्रीका और अमेरिका सहित दुनिया के कई क्षेत्रों में तिलपिया मौतों का कारण बनती है । इस बीमारी को पहली बार इसराइल में 2009 में तिलपिया की सामूहिक मृत्यु दर के दौरान पहचाना गया था, जहां Kinneret झील में जंगली तिलपिया की संख्या नाटकीय रूप से 257 से 8 टन प्रतिवर्षघटी। यह बीमारी तिलपिया झील वायरस (TiLV) के कारण होती है, जिसे एक नए जीनस तिलापिनाइनवायरस और एक नई प्रजाति तिलापिया तिलापिनाइनवायरस3के रूप में अनोनोविरिडी परिवार को सौंपा गया है । TiLV के आनुवंशिक लक्षण वर्णन से पता चला है कि वायरस एक उपन्यास छा, नकारात्मक भावना, एकल फंसे आरएनए वायरस है कि 10 खंडों 10 प्रोटीनएन्कोडिंग है 1,,2,,4। सरोथेरोडन, ओरेओक्रोमोसिस,और तिलापाइन और अन्य गर्म पानी की मछली (जैसे, विशालकाय गौरामी(ओस्फ्रेनोमस गोरमी)जीनस में तिलपिया की विभिन्न प्रजातियों को टिल्व2,5के लिए अतिसंवेदनशील दिखाया गया है। वर्तमान में, यह वायरस विश्व स्तर पर फैलता रहता है, संभवतः संक्रमित जीवित मछली6,,7के आंदोलन के माध्यम से, जबकि जमे हुए तिलपिया या उसके उत्पाद के माध्यम से वायरल संचरण का खतरासीमित 8है। TiLV संक्रमण के कारण पर्याप्त मृत्यु दर तिलपिया उद्योग पर काफी हानिकारक आर्थिक प्रभाव पड़ने की क्षमता है। उदाहरण के लिए, TiLV संक्रमण से जुड़े मिस्र में ग्रीष्मकालीन मृत्यु सिंड्रोम के आर्थिक प्रभाव की गणना 100 मिलियन अमेरिकी डॉलर9की थी । तदनुसार, मछली के खेतों में इस बीमारी के नियंत्रण को सुविधाजनक बनाने के लिए एक त्वरित और उचित नैदानिक विधि विकसित करना महत्वपूर्ण है।
अब तक, TiLVD का निदान आणविक परख, वायरल अलगाव, और हिस्टोपैथोलॉजी पर आधारित रहा है। टीआईएलवी डायग्नोसिस10,11के लिए विभिन्न पीसीआर प्रोटोकॉल और प्राइमर विकसित किए गए हैं . उदाहरण के लिए, एक SYBR हरे आधार पर रिवर्स प्रतिलेखन मात्रात्मक पीसीआर (आरटी-qPCR) विधि संवेदनशीलता के साथ वायरस की दो प्रतियां/μL के रूप में कुछ के रूप में पता लगाने के लिए विकसित किया गया है और TiLV पता लगाने10के लिए मांय । TiLV का पता लगाने के लिए अन्य पीसीआर तरीकों में TaqMan मात्रात्मक पीसीआर11,आरटी-पीसीआर2,नेस्टेड आरटी-पीसीआर12और अर्ध-नेस्टेड आरटी-पीसीआर13शामिल हैं । हालांकि, इन तरीकों को परिष्कृत प्रयोगशाला उपकरणों और प्रतिक्रियाओं की जटिलता के कारण परिणाम प्राप्त करने के लिए अपेक्षाकृत विस्तारित समय की आवश्यकता होती है, जो उन्हें क्षेत्र आवेदन के लिए अनुपयुक्त बनाता है।
लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (लैंप) परख एक तेजी से, सरल और व्यावहारिक के लिए क्षेत्र आवेदन14,,15है । यह तकनीक एक स्ट्रैंड विस्थापन प्रतिक्रिया के सिद्धांत को नियोजित करती है, जबकि प्रवर्धन प्रतिक्रिया एक परिष्कृत और महंगे थर्मल साइकिलर14,,15के बिना आइसोथर्मल परिस्थितियों में चलती है। नतीजतन, एम्पलीफाइड लैंप उत्पादों या आरटी-लैंप उत्पादों का विश्लेषण सीढ़ी-जैसे बैंड में डीएनए या आरएनए14 के सुरक्षित दृश्य के लिए फ्लोरोसेंट दाग के साथ एग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके किया जाता है या टर्बिडिटी या सफेद उपजी16,,17,,18की उपस्थिति के लिए नग्न आंखों के साथ अवलोकन होता है। इन कारणों से इस तकनीक का उपयोग विभिन्न मछली रोगजनकों17, 18 ,,,,,19,20,18,21,22,23 ,24,25,26,27का ऑन साइट पता लगाने के लिए किया गया है ।24 इस अध्ययन का उद्देश्य TiLV का पता लगाने के लिए एक तेजी से, संवेदनशील, और सटीक आरटी-लैंप परख स्थापित करना था। आरटी-लैंप परख 30 मिनट के भीतर मछली के नमूनों में TiLV के लिए स्क्रीनिंग प्रदान करता है । इस तकनीक को TiLVD के निदान और निगरानी के लिए लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
जलकृषि उद्योग को लगातार वायरल संक्रमण ों से खतरा है जिससे9,23,,28को काफी आर्थिक नुकसान होता है . उदाहरण के लिए, उभरते TiLV दुनिया के कई भागों में तिलपिया उत्पादक देशों के लिए…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
परियोजना को थाईलैंड अनुसंधान कोष (टीआरएफ) अनुदान संख्या RDG6050078 और कृषि और खाद्य के लिए उन्नत अध्ययन के लिए केंद्र, उन्नत अध्ययन संस्थान, Kasetsart विश्वविद्यालय, बैंकॉक, थाईलैंड के उच्च शिक्षा अनुसंधान संवर्धन और थाईलैंड के राष्ट्रीय अनुसंधान विश्वविद्यालय परियोजना, उच्च शिक्षा आयोग के कार्यालय, शिक्षा मंत्रालय, थाईलैंड द्वारा वित्त पोषित है । अनुसंधान स्नातक स्कूल, Kasetsart विश्वविद्यालय से स्नातक कार्यक्रम छात्रवृत्ति द्वारा भाग में समर्थित है । लेखक वीडियो और पियावातारा सिकिइन की कथा बोलने के लिए डॉ क्वांवी सिरिककंचना को वीडियो के संपादन के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे ।
Materials
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| – Direct-zol RNA PreWash | |||
| – RNA Wash Buffer | |||
| – DNase/RNase-free water | |||
| – Zymo-spin IIICG columns | |||
| – Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| – Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| – Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| – Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
Referências
- Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
- Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
- Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
- Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
- Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
- Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , (2017).
- Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
- Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
- Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by ‘summer mortality’ syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
- Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
- Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
- Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
- Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).
- Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
- Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
- Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
- Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
- Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
- Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
- Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. Biologia do Desenvolvimento. 121, 255-261 (2005).
- Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
- Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
- Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
- Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
- Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).
