Использование цитометрии потока для обнаружения и количественного изменения формации крови в развивающейся зебрефиш
Summary
Этот анализ является простым методом количественно гематопоэтических клеток в развивающихся эмбриональных зебры. Клетки крови от диссоциированных зебры подвергаются анализу цитометрии потока. Это позволяет выявлять дефекты крови у животных-мутантов и после генетической модификации.
Abstract
Разнообразие клеточных линий, составляющих зрелую кровь у позвоночных животных, возникает в результате дифференциации гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (ГСПК). Это критический процесс, который происходит на протяжении всей жизни организмов, и нарушение молекулярных путей, участвующих во время эмбриогенеза может иметь катастрофические долгосрочные последствия. По множеству причин,зебрафиш (Danio rerio) стала моделью организма для изучения гематопоеза. Эмбрионы зебры развиваются внешне, и к 7 дням постферизайние (dpf) произвело большинство подтипов окончательных клеток крови, которые будут сохраняться в течение их жизни. Анализы для оценки количества гематопоэтических клеток были разработаны, в основном с использованием конкретных гистологических пятен, на месте методы гибридизации, и микроскопия трансгенных животных, которые используют клетки крови конкретных промоутеров вождения выражение флуоресцентных белков. Тем не менее, большинство окрашивания анализы и на месте методы гибридизации точно не количественно количество клеток крови настоящее время; только большие различия в числах клеток легко визуализированы. Использование трансгенных животных и анализ лиц с флуоресцентной или конфокаленной микроскопией может быть выполнена, но количественная оценка этих анализов зависит либо от подсчета вручную, либо от использования дорогостоящего программного обеспечения для визуализации, оба из которых могут делать ошибки. Разработка дополнительных методов для оценки количества клеток крови будет экономичной, быстрее, и даже может быть автоматизирована, чтобы быстро оценить влияние CRISPR-опосредованные генетической модификации, морфолино-опосредованное сокращение стенограммы, и влияние лекарственных соединений, которые влияют на гематопоеза в больших масштабах. Этот новый анализ количественных клеток крови выполняется путем разобщенности целых эмбрионов зебры и анализа количества флуоресцентно помеченных клеток крови присутствует. Эти анализы должны позволить выяснение молекулярных путей, ответственных за генерацию клеток крови, расширение и регулирование во время эмбриогенеза, что позволит исследователям в дальнейшем обнаружить новые факторы, измененные во время заболеваний крови, а также пути, необходимые во время эволюции позвоночных гематопоэз.
Introduction
Производство крови (гематопоезис) является важным процессом развития, который впервые начинается в раннем эмбрионе. Этот процесс начинается с генерации примитивных красных кровяных телец и макрофагов непосредственно из мезодерма, а затем смещается в сторону производства гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (ГФУ). Эти стволовые клетки, которые являются многопотентными, генерируют все разновидности зрелых клеток крови в организме. Способная к самооб обновлению, система постоянно пополняется через эти ГЦП. В то время как этот процесс начинается на ранних стадиях развития, гематопоеза продолжается для жизни животного, обеспечивая возможность транспортировки кислорода в отдаленные места тела, чтобы остановить кровотечение после травмы, и защитить организм от инфекции. Развитие этой сложной системы контролируется временно и пространственно во время развития, и любые возмущения в производстве клеток крови могут быть катастрофическими для организма, что приводит к анемии, тромбоцитопении, лейкопении и лейкемии.
Популярной моделью животных, используемой для гематопоэтических исследований, является зебрафиш(Danio rerio),потому что они имеют аналогичное развитие крови по сравнению с людьми. В самом деле, многие из генов и молекулярных путей, используемых во время гематопоэза сохраняется на протяжении всей эволюции позвоночных, что позволяет нам узнать о человеческих генах, изучая зебры. Важно отметить, что эмбрионы зебры развиваются вне тела и в течение 7 дней породили большинство зрелых типов клеток крови, что позволяет для прямой визуализации гематопоэтической системы в короткий промежуток времени. Зебрафиш также чрезвычайно fecund, что позволяет исследователям наблюдать большее количество образцов в короткие сроки, что также важно для генерации воспроизводимых данных. Короткое время генерации зебры и внешнее развитие обеспечивает более легкую манипуляцию и наблюдение во время исследований мутагенеза1,2,3,4,5 и скринингапрепарата 6,7,8,9,10. Это позволяет группе перспективных терапевтических соединений для человеческих заболеваний крови, чтобы быть быстро и эффективно протестированы.
Важно отметить, что зебры также генетически подложки, и геном секвенирован и аннотирован. Эта трактуируемость позволяет обратные методы генетики, такие как морфолино- (MO-) опосредованное нокдаун и CRISPR-опосредованной генетической абляции, которые будут выполняться. Зебрафиш также доказали свою полезность в качестве модели для выполнения вперед генетических экранов; многие основные гены и пути, участвующие в формировании крови позвоночных были обнаружены таким образом. Многочисленные методы наблюдения клеток крови были также разработаны в зебры. В то время как традиционные гистологические методы окрашивания существуют, можно также выполнить на месте гибридизации для крови конкретных стенограмм. Важно отметить, что многочисленные трансгенные линии рыбы также существуют в соответствии с которой флуоресцентные белки выражаются линии конкретных промоутеров, что позволяет маркировки конкретных клеток крови сфлуоресцентными белками 11. Это позволяет исследователям выполнять до минуты наблюдения генезиса клеток крови, расширение и регулирование в живом организме с течением времени.
В целом, сохранение гематопоэтической системы, наличие и легкое развитие трансгенных линий, легкая визуализация и короткое время генерации сделали зебру экономичной, быстрой и адаптируемой моделью гематопоэза. Чтобы улучшить набор инструментов, доступных для исследователей зебры, мы разработали этот анализ, чтобы надежно количественно количество клеток крови в эмбрионах. Метод включает переваривание трансгенных животных и выполнение цитометрии потока для флуоресцентных клеток крови. Таким образом, клетки крови животных-мутантов, эффект модификации MO и CRISPR, а также эффект малых молекул могут быть количественно проанализированы в быстрой и воспроизводимой манере. Эти анализы являются удобными и экономичными способами перечисления клеток крови, что позволяет с течением времени изутовить их генерацию, распространение и техническое обслуживание.
Protocol
Representative Results
Discussion
Зебрафиш являются отличной моделью системы для изучения примитивных и окончательных позвоночных гематопоэзиса. За последние несколько десятилетий, несколько анализов были разработаны и уточнены, что позволяет зебры, чтобы стать быстрой и экономичной моделью для тестирования наркот?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование было предоставлено Национальными институтами здравоохранения (NIH: R15 DK114732-01 в D.L.S.), Национальным научным фондом (NSF: MRI 1626406 до D.L.S.), а также программой Почета в Калифорнийском государственном университете Чико (К.Ф.Р.). Авторы благодарят Бетси Тамиетти за лабораторное управление и Кэти Джонс за административную помощь.
Materials
| 1.5 ml MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 10 mm Polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| 5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| BD FACSAria Fusion flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| Librease | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| SYTOX Red Dead Cell Stain | Invitrogen | S34859 |
Referências
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. , 303-309 (1996).
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes & Development. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).
- Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).
- Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. . Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , (2009).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. Zebrafish Kidney Development. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. 100, 233-260 (2010).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).
- Ganis, J. J., et al. Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR. Biologia do Desenvolvimento. 366, 185-194 (2012).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, e1-e11 (2013).
- Ding, M., et al. Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective. SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).
- Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies. Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).
- Joslin, J., et al. A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery. SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).
