Använda flödescytometri för att upptäcka och kvantifiera förändrad blodbildning i den utvecklande zebrafisken
Summary
Denna analys är en enkel metod för att kvantifiera hematopoetiska celler för att utveckla embryonala zebrafiskar. Blodkroppar från dissocierade zebrafiskar utsätts för flödescytometrianalys. Detta gör det möjligt att upptäcka bloddefekter hos muterade djur och efter genetisk modifiering.
Abstract
Mångfalden av cellstammar som består av moget blod hos ryggradsdjur härrör från differentiering av hematopoetiska stam- och stamceller (HSPCs). Detta är en kritisk process som sker under organismers hela livslängd, och störningar av de molekylära vägarna som är involverade under embryogenes kan få katastrofala långsiktiga konsekvenser. Av en mängd olika skäl har zebrafisk (Danio rerio) blivit en modellorganism för att studera hematopoiesis. Zebrafiskembryon utvecklas externt, och med 7 dagar efter efterfertilisering (dpf) har producerat de flesta subtyperna av definitiva blodkroppar som kommer att kvarstå under sin livstid. Analyser för att bedöma antalet hematopoetiska celler har utvecklats, främst med hjälp av specifika histologiska fläckar, in situ hybridiseringstekniker och mikroskopi av transgena djur som använder blodcellsspecifika promotors som driver uttrycket av fluorescerande proteiner. De flesta färgningsanalyser och hybridiseringstekniker på plats kvantifierar dock inte exakt antalet närvarande blodkroppar. Endast stora skillnader i cellantal visualiseras enkelt. Att använda transgena djur och analysera individer med fluorescerande eller konfokal mikroskopi kan utföras, men kvantifieringen av dessa analyser förlitar sig på att antingen räkna manuellt eller använda dyr bildprogramvara, som båda kan göra fel. Utveckling av ytterligare metoder för att bedöma blodcellsnummer skulle vara ekonomisk, snabbare och kan till och med automatiseras för att snabbt bedöma effekten av CRISPR-medierad genetisk modifiering, morpholino-medierad transkriptionsminskning och effekten av läkemedelsföreningar som påverkar hematopoiesis i stor skala. Denna nya analys för att kvantifiera blodkroppar utförs genom att dissociera hela zebrafiskembryon och analysera mängden fluorescerande märkta blodkroppar som finns. Dessa analyser bör möjliggöra klargörande av molekylära vägar som ansvarar för blodcellsgenerering, expansion och reglering under embryogenes, vilket gör det möjligt för forskare att ytterligare upptäcka nya faktorer som förändrats under blodsjukdomar, liksom vägar som är väsentliga under utvecklingen av ryggradsdjur hematopoiesis.
Introduction
Blodproduktion (hematopoiesis) är en viktig utvecklingsprocess som först börjar i det tidiga embryot. Denna process börjar med att generera primitiva röda blodkroppar och makrofager direkt från mesoderm, och skiftar senare mot produktion av hematopoetiska stam- och stamceller (HSPCs). Dessa stamceller, som är multipotenta, genererar alla sorter av mogna blodkroppar i organismen. Systemet kan förnya sig själv och fylls kontinuerligt på via dessa HSPC:er. Medan denna process börjar tidigt i utvecklingen, fortsätter hematopoiesis för djurets liv, vilket ger möjlighet att transportera syre till avlägsna platser i kroppen, att sluta blöda efter skada och att skydda kroppen från infektion. Utvecklingen av detta komplexa system kontrolleras tidsmässigt och rumsligt under utveckling och eventuella förändringar i blodcellsproduktionen kan vara katastrofala för organismen, vilket resulterar i anemi, trombocytopeni, leukopeni och leukemi.
En populär djurmodell som används för hematopoetisk forskning är zebrafisken (Danio rerio) eftersom de har liknande blodutveckling jämfört med människor. Faktum är att många av de gener och molekylära vägar som används under hematopoiesis bevaras genom hela ryggradsdjursutvecklingen, så att vi kan lära oss om mänskliga gener genom att studera zebrafisk. Viktigt är att zebrafiskembryon utvecklas utanför kroppen och inom 7 dagar har genererat de flesta mogna blodcellstyper, vilket möjliggör direkt visualisering av det hematopoetiska systemet på kort tid. Zebrafisk är också extremt fecund, vilket gör det möjligt för forskare att observera ett större antal prover på kort tid, vilket också är viktigt för att generera reproducerbara data. Zebrafiskens korta generationstid och externa utveckling ger lättare manipulering och observation under mutagenesstudier1,2,3,4,5 och läkemedelsscreening6,7,8,9,10. Detta gör det möjligt att snabbt och effektivt testa en panel av lovande terapeutiska föreningar för mänskliga blodsjukdomar.
Viktigt är att zebrafisk också är genetiskt mottaglig, och genomet är sekvenserat och kommenterat. Denna kantbarhet gör det möjligt att utföra omvända genetiktekniker som morpholino- (MO-) medierad knockdown och CRISPR-medierad genetisk ablation. Zebrafisk har också bevisat sitt användbarhet som modell för att utföra framåtriktade genetiska skärmar; många viktiga gener och vägar som är involverade i ryggradsdjur blod bildas har upptäckts på detta sätt. Många metoder för att observera blodkroppar har också utvecklats i zebrafisk. Medan traditionella histologiska färgningstekniker finns, är det också möjligt att utföra in situ hybridisering för blodspecifika transkriptioner. Det är viktigt att det finns många transgena fiskartlinjer där fluorescerande proteiner uttrycks av härstamningsspecifika promotors, vilket gör det möjligt att märka specifika blodkroppar med fluorescerandeproteiner 11. Detta gör det möjligt för forskare att utföra den snabba observationen av blodcellsuppkomst, expansion och reglering i en levande organism över tid.
Sammantaget har bevarandet av det hematoopoetiska systemet, närvaron och den enkla utvecklingen av transgena linjer, enkel visualisering och kort generationstid gjort zebrafisken till en ekonomisk, snabb och anpassningsbar modell av hematopoiesis. För att förbättra verktygslådan med tekniker tillgängliga för zebrafiskforskare utvecklade vi denna analys för att robust kvantifiera antalet blodkroppar i embryon. Metoden innebär att smälta transgena djur och utföra flödescytometri för fluorescerande blodkroppar. På detta sätt kan blodkroppar från muterade djur, effekten av MO- och CRISPR-modifiering och effekten av små molekyler kvantitativt analyseras på ett snabbt och reproducerbart sätt. Dessa analyser är användarvänliga och ekonomiska sätt att räkna upp blodkroppar, vilket möjliggör undersökning av deras generation, spridning och underhåll över tid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafisk är ett utmärkt modellsystem för att studera primitiva och definitiva ryggradsdjur hematopoiesis. Under de senaste decennierna har flera analyser utvecklats och förfinats, vilket gör det möjligt för zebrafisk att bli en snabb och ekonomisk modell för att testa läkemedel, generera och testa genetiska mutanter och totalt sett göra det möjligt för forskare att analysera molekylära vägar som är väsentliga för hematopoiesis. Detta protokoll använder embryonala zebrafiskar som möjliggör snabb datai…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering tillhandahölls av National Institutes of Health (NIH: R15 DK114732-01 till D.L.S.), National Science Foundation (NSF: MRI 1626406 till D.L.S.), och från Honor’s Program vid California State University Chico (till K.F.R.). Författarna tackar Betsey Tamietti för laboratorieledningen och Kathy Johns för administrativ hjälp.
Materials
| 1.5 ml MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 10 mm Polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| 5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| BD FACSAria Fusion flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| Librease | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| SYTOX Red Dead Cell Stain | Invitrogen | S34859 |
Referências
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. , 303-309 (1996).
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes & Development. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).
- Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).
- Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. . Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , (2009).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. Zebrafish Kidney Development. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. 100, 233-260 (2010).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).
- Ganis, J. J., et al. Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR. Biologia do Desenvolvimento. 366, 185-194 (2012).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, e1-e11 (2013).
- Ding, M., et al. Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective. SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).
- Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies. Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).
- Joslin, J., et al. A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery. SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).
