تطبيق المجهر القوة الذرية للكشف عن هشاشة العظام في وقت مبكر
Summary
نحن نقدم طريقة للتحقيق في التغيرات المبكرة هشاشة العظام على المستوى الخلوي في الغضروف المفصلي باستخدام المجهر القوة الذرية (AFM).
Abstract
الخصائص الميكانيكية الحيوية للخلايا والأنسجة ليس فقط تنظيم شكلها ووظيفتها ولكن أيضا حاسمة للحفاظ على حيويتها. يمكن أن تنتشر التغيرات في المرونة أو تؤدي إلى ظهور أمراض رئيسية مثل السرطان أو هشاشة العظام (OA). وقد برز المجهر القوة الذرية (AFM) كأداة قوية لتوصيف الخصائص الميكانيكية الحيوية للهياكل المستهدفة البيولوجية المحددة على نطاق مجهري، وقياس القوى في نطاق صغير مثل بيكونيوتن إلى ميكرونيوتن. خصائص البيوميكانيكية ذات أهمية خاصة في الأنسجة العضلية الهيكلية، والتي تتعرض لمستويات عالية من الإجهاد. OA كمرض تنكسي من الغضروف يؤدي إلى تعطيل المصفوفة المحيطة بالخلية (PCM) وإعادة ترتيب المكانية من chondrocytes جزءا لا يتجزأ من مصفوفة خارج الخلية (ECM). وقد ارتبط اضطراب في PCM وECM مع تغييرات في الخصائص الميكانيكية الحيوية للغضاريف. في هذه الدراسة استخدمنا AFM لقياس هذه التغيرات فيما يتعلق بتغيرات النمط المكاني المحددة للشوندروكويت. ومع كل تغير في النمط، لوحظت تغيرات كبيرة في المرونة بالنسبة لكل من PCM وECM. وبالتالي فإن قياس المرونة المحلية يسمح باستخلاص استنتاجات مباشرة حول درجة انحطاط الأنسجة المحلية في OA.
Introduction
الغضروف المفصلي هو نسيج وعائي وعصبي. تنتج chondrocytes المتناثرة بشكل متفرق ، وتنظم ، وتحافظ على مصفوفة خارج الخلية توسعية (ECM) التي يتم تضمينها فيها. كجزء متميز ومتخصص من ECM ، تحيط chondrocytes بطبقة رقيقة من المصفوفة المتخصصة المعروفة باسم المصفوفة المحيطة بالخلية (PCM). PCM بمثابة واجهة الخلية مصفوفة الميشانوحساس1 الذي يحمي chondrocytes2 وتعدل استجابتها biosynthetic3. كما وصف سابقا4، في غضروف صحي ، يتم ترتيب chondrocytes في أنماط مكانية محددة ومتميزة محددة لكل طبقة نسيج ومشترك4،5 وتعتمد على آليات التحميل الميكانيكية الخاصة بالمفاصل6. تتغير هذه الأنماط من الأزواج والسلاسل في الغضروف الصحي إلى سلاسل مزدوجة مع بداية هشاشة العظام (OA). مع مزيد من التقدم للمرض تشكل chondrocytes مجموعات صغيرة ، وزيادة تدريجية في الحجم إلى مجموعات كبيرة في OA المتقدمة. ويلاحظ فقدان كامل لأي هيكل تنظيمي وتحريض المبرمج في نهاية المرحلة OA. وهكذا، يمكن استخدام ترتيب الخلوية chondrocyte كعلامة بيولوجية على أساس الصورة للتقدم OA4.
الخصائص الميكانيكية الحيوية للخلايا والأنسجة ليس فقط تنظيم شكلها ووظيفتها ولكن أيضا حاسمة للحفاظ على حيويتها. يمكن أن تنتشر التغيرات في المرونة أو تؤدي إلى ظهور أمراض رئيسية مثل السرطان أو OA. وقد برز المجهر القوة الذرية كأداة قوية لتوصيف الخصائص الميكانيكية الحيوية للهياكل المستهدفة البيولوجية المحددة على نطاق مجهري، وقياس مجموعة واسعة من القوة، من بيكونيوتن إلى الميكرونيوتن. التطبيق الرئيسي للAFM هو قياس التضاريس السطحية والخصائص الميكانيكية للعينات في قرار مقياس تحت النانو7. يتكون جهاز القياس من ثلاثة مكونات رئيسية: 1) مسبار AFM ، وهو عبارة عن طرف حاد مثبت على الكانتيليفر ويستخدم للتفاعل المباشر مع سطح العينة. عندما يتم تطبيق القوة على cantilever ، يحدث تشوه هذا الأخير وفقًا لخصائص الأنسجة المقاسة. 2) نظام بصري أن المشاريع شعاع الليزر على cantilever، والتي تنعكس بعد ذلك إلى وحدة كاشف. 3) كاشف الديويدي الضوئية التي تلتقط الضوء منحرفة من cantilever. فإنه يحول المعلومات الواردة بشأن انحراف الليزر من قبل cantilever إلى منحنى القوة التي يمكن تحليلها.
وبالتالي، فإن المبدأ الرئيسي للإدارة الاستراتيجية هو الكشف عن القوة التي تعمل بين مسبار AFM والهيكل المستهدف للعينة. المنحنيات قوة حصلت وصف الخصائص الميكانيكية للهياكل المستهدفة على سطح العينة مثل مرونة، وتوزيع الشحن، المغناطيسية، والإجهاد العائد، ومرونة ديناميات تشوه البلاستيك8. ميزة هامة من AFM على تقنيات التصوير الأخرى هو أن AFM يمكن استخدامها لقياس الخصائص الميكانيكية للخلايا الحية في متوسطة أو أنسجة في حالة أصلية دون إتلاف الأنسجة. يمكن أن تعمل AFM في ظروف سائلة أو جافة. لا يوجد أي شرط لإعداد العينة. يوفر AFM إمكانية صورة عينة وقياس خصائصها الميكانيكية في وقت واحد في العينات القريبة من الظروف الفسيولوجية. في هذه الدراسة وصفنا نهجا جديدا لتقييم تطور OA من خلال قياس مرونة PCM وECM في الغضروف المفصلي الأصلي. إن ارتباط التنظيم المكاني للتشوندروكوتس بدرجة انحطاط الأنسجة المحلية يوفر منظورًا جديدًا تمامًا للكشف المبكر عن OA. بيد أن الأهمية الوظيفية لهذه الأنماط لم تقيَّم حتى الآن. لأن الوظيفة الرئيسية للغضروف المفصلي هو الحمل تحمل في احتكاك منخفض، يجب أن تمتلك الأنسجة خصائص مرنة. AFM يسمح قياس ليس فقط مرونة ECM ولكن أيضا من الأنماط الخلوية المكانية جزءا لا يتجزأ من PCM بهم. الارتباط الملحوظ للمرونة مع تغيير النمط المكاني للchondrocytes قوي لدرجة أن قياس المرونة وحدها قد يسمح بالتقسيم الطبقي لانحطاط الأنسجة المحلية.
تم تقييم مودولي مرن ة من PCM و ECM في 35 ميكرومتر رقيقة المقاطع باستخدام نظام AFM متكاملة في مجهر تباين المرحلة المقلوبة التي سمحت التصور في وقت واحد من عينة الغضاريف. ويستند هذا البروتوكول على دراسة نشرت بالفعل من مختبرنا9 ويصف على وجه التحديد كيفية توصيف الترتيب المكاني للchondrocytes وكيفية قياس مرونة PCM المرتبطة بها وECM. مع كل تغيير نمط من chondrocytes، يمكن أيضا ملاحظة تغييرات كبيرة في مرونة لكل من PCM وECM، مما يسمح لهذه التقنية لاستخدامها لقياس مباشرة مرحلة انحطاط الغضاريف.
يفتح هذا النهج المعتمد طريقة جديدة لتقييم تطور OA والآثار العلاجية في المراحل المبكرة قبل أن يبدأ تدهور الأنسجة العيانية في الظهور فعليًا. إن إجراء قياسات AFM باستمرار عملية شاقة. في البروتوكول التالي، نصف كيفية إعداد العينة التي سيتم قياسها بواسطة AFM، وكيفية إجراء قياسات AFM الفعلية بدءًا من إعداد الكانتيليفر، وكيفية معايرة AFM، ثم كيفية إجراء القياسات. وتعطي التعليمات خطوة بخطوة نهجا واضحا وموجزا للحصول على بيانات موثوقة وتوفير استراتيجيات أساسية لمعالجتها وتفسيرها. يصف قسم المناقشة أيضًا المزالق الأكثر شيوعًا لهذه الطريقة الصارمة ويوفر نصائح مفيدة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام AFM كتقنية جديدة وقوية لقياس الخصائص الميكانيكية الحيوية للمواد البيولوجية على مستوى النانو، قمنا بقياس الخصائص المرنة لـ ECM و PCM في الغضروف المفصلي لهشاشة العظام البشرية. تم اختيار عينات الغضاريف وفقًا لنمطها المكاني السائد في منظمة chondrocyte كعلامة بيولوجية قائمة على الصور لانحطا?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر المؤلفين المشاركين من المنشور الأصلي على مساعدتهم ودعمهم.
Materials
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
Referências
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al. The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis. Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).
- Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production. Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).
- Polini, A., Yang, F., Ramalingam, M., Ramakrishna, S. Physicochemical characterization of nanofiber composites. Nanofiber Composites for Biomedical Applications. , 97-115 (2017).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis–I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).
- Choi, A. P., Zheng, Y. P. Estimation of Young’s modulus and Poisson’s ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect. Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).
- Jin, H., Lewis, J. L. Determination of Poisson’s ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).
