原子力显微镜在早期骨关节炎检测中的应用
Summary
我们提出了一种使用原子力显微镜（AFM）研究关节软骨细胞水平上早期骨关节炎变化的方法。
Abstract
细胞和组织的生物力学特性不仅调节其形状和功能，而且对保持其活力也至关重要。弹性的变化可以传播或触发癌症或骨关节炎（OA）等主要疾病的发病。原子力显微镜（AFM）已成为一种强大的工具，用于在微观尺度上定性和定量地描述特定生物目标结构的生物力学特性，测量从小到小到微牛顿的力。生物力学特性在肌肉骨骼组织中特别重要，肌肉骨骼组织受到高水平的应变。OA作为软骨的退行性疾病，导致细胞外基质（PCM）的中断和细胞外基质（ECM）中嵌的软骨细胞的空间重新排列。PCM 和 ECM 的中断与软骨生物力学特性的变化有关。在本研究中，我们使用 AFM 来量化这些与软骨细胞特定空间模式变化相关的变化。每次模式变化时，PCM 和 ECM 的弹性都会显著变化。因此，测量局部弹性可以直接得出OA中局部组织退化程度的结论。
Introduction
关节软骨是一种血管性神经性组织。稀疏分散的软骨细胞产生、组织和维护一个膨胀的细胞外基质（ECM），它们嵌入其中。作为 ECM 的一个独特和专门部分，软体细胞被称为近细胞基质 （PCM） 的一层薄薄的专用基质所包围。PCM充当一个对化学敏细胞-基质接口1，保护软糖2并调节其生物合成反应3。如前所述4，在健康的软骨中，软骨细胞排列在特定的，独特的空间模式，是特定于每个组织层和关节4,4，5，并依赖于关节特定的机械加载机制6。这些模式从健康软骨中的对和字符串变为骨关节炎 （OA） 发病的双字符串。随着疾病的进一步进展，软骨细胞形成小簇，在高级OA中逐渐增加到大簇。在OA末期观察到完全丧失任何组织结构和诱导凋亡。因此，软骨细胞排列可用作OA进展4的基于图像的生物标志物。
细胞和组织的生物力学特性不仅调节其形状和功能，而且对保持其活力也至关重要。弹性的变化可以传播或触发癌症或OA等主要疾病的发病。原子力显微镜（AFM）已成为一种强大的工具，用于在微观尺度上定性和定量地描述特定生物目标结构的生物力学特性，测量从皮科牛顿到微牛顿的各种力。AFM的主要应用是测量样品的表面地形和在亚纳米分辨率7下的变化。测量装置由三个主要组件组成：1） AFM 探头，这是安装在悬臂上的尖尖，用于与样品表面的直接交互。当力施加到悬臂上时，后者根据测量的组织特性发生变形。2） 将激光束投射到悬臂上的光学系统，然后反射到探测器单元。3） 光电二极管探测器，可捕获从悬臂偏转的光。它将收到的有关悬臂激光偏转的信息转换为可分析的力曲线。
因此，AFM的主要原理是检测AFM探头与样品目标结构之间的力。所得力曲线描述了样品表面目标结构的力学特性，如弹性、电荷分布、磁化、屈服应力和弹性塑性变形动力学8。与其他成像技术AFM的一个重要优点是，AFM可用于测量处于原生状态的中等或组织中活细胞的机械特性，而不会损坏组织。AFM 可在液体或干燥条件下工作。样品制备没有要求。AFM 提供了在接近生理条件的标本中同时成像标本并测量其机械特性的可能性。在本研究中，我们描述了一种通过测量原生关节软骨中 PCM 和 ECM 的弹性来评估 OA 进展的新方法。软骨细胞的空间组织与局部组织退化程度的相关性为早期发现OA提供了一个全新的视角。然而，迄今尚未评估这些模式的功能相关性。由于关节软骨的主要功能是低摩擦时承重，组织必须具有弹性特性。AFM 不仅允许测量 ECM 的弹性，还允许测量嵌入到 PCM 中的空间细胞模式。观察到的弹性与软骨细胞空间模式变化的相关性非常强，仅靠测量弹性就可能允许局部组织退化的分层。
使用集成在倒置相对比显微镜中的 AFM 系统，对 PCM 和 ECM 的弹性面进行了 35 μm 薄部分的评估，该显微镜可同时可视化软骨样品。该协议基于我们的实验室9已经发表的一项研究，并具体描述了如何描述软骨细胞的空间排列，以及如何测量其相关的PCM和ECM的弹性。随着软骨的每次模式变化，PCM和ECM的弹性也会发生重大变化，从而允许该技术直接测量软骨退化的阶段。
这种经过验证的方法为在宏观组织退化真正开始出现之前的早期阶段评估OA进展和治疗效果开辟了一条新途径。持续执行 AFM 测量是一个艰巨的过程。在以下协议中，我们将介绍如何准备由 AFM 测量的样品，如何从准备悬臂开始执行实际的 AFM 测量，如何校准 AFM，以及如何执行测量。分步说明提供了一种清晰、简洁的方法，以获得可靠的数据，并提供处理和解释数据的基本策略。讨论部分还介绍了此严格方法的最常见缺陷，并提供了有用的故障排除提示。
Protocol
Representative Results
Discussion
利用AFM作为一种新颖而强大的技术，在纳米级水平上测量生物材料的生物力学特性，测量了ECM和PCM在人类骨关节炎关节软骨中的弹性特性。软骨样本是根据其主要空间模式选择软骨细胞组织作为图像为基础的生物标志物，用于局部组织退化。正如预期的那样，在空间软骨重组中观察到ECM和PCM的弹性值急剧下降。这些观测结果清楚地突出表明，软骨细胞空间排列的偏差不仅与细胞微环境（PCM）的弹?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢原出版物的合著者的帮助和支持。
Materials
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
Referências
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al. The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis. Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).
- Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production. Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).
- Polini, A., Yang, F., Ramalingam, M., Ramakrishna, S. Physicochemical characterization of nanofiber composites. Nanofiber Composites for Biomedical Applications. , 97-115 (2017).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis–I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).
- Choi, A. P., Zheng, Y. P. Estimation of Young’s modulus and Poisson’s ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect. Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).
- Jin, H., Lewis, J. L. Determination of Poisson’s ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).
