יישום של מיקרוסקופ כוח אטומי כדי לזהות אוסטיאוארתריטיס מוקדם
Summary
אנו מציגים שיטה לחקור שינויים אוסטאופתית מוקדם ברמה התאית בסחוס הפרקולריות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).
Abstract
תכונות ביומכאניות של תאים ורקמות לא רק לווסת את צורתם ואת התפקוד אלא גם חיוני לשמירה על החיוניות שלהם. שינויים אלסטיות יכול להפיץ או להפעיל את תחילתה של מחלות גדולות כמו סרטן או אוסטיאוארתריטיס (OA). המיקרוסקופיה של הכוח האטומי (AFM) התפתחה ככלי חזק לאיכות ולכימות המאפיינים את התכונות הביומכאניות של מבני יעד ביולוגיים ספציפיים בקנה מידה מיקרוסקופי, כוחות מדידה בטווח מ קטן כמו piconewton אל מיקרואוטון. תכונות ביומכאניות הן בעלות חשיבות מיוחדת ברקמות שריר השלד, אשר חשופים לרמות גבוהות של מתח. OA כמחלה ניוונית של הסחוס תוצאות השיבוש של המטריצה הפראיסלנדי lular (PCM) ואת הסידור המרחבי של כונדרוציטים מוטבע מטריצה החילוץ שלהם (ECM). שיבוש PCM ו ECM כבר שויך שינויים בתכונות הביומכאניות של סחוס. במחקר הנוכחי השתמשנו AFM לכמת את השינויים האלה ביחס השינויים דפוס מרחבית ספציפיים של כונדרוציטים. עם כל שינוי דפוס, שינויים משמעותיים אלסטיות נצפו עבור ה-PCM ו-ECM. מדידת האלסטיות המקומית ובכך מאפשרת רישום מסקנות ישירות על מידת ניוון רקמות מקומיות OA.
Introduction
הסחוס הנמק העצם. הוא רקמה מיועלת כונדרוציטים בדלילות לייצר, לארגן, ולשמור על מטריצה החילוץ ולקיבולת (ECM) שאליו הם מוטבעים. כחלק ברור ומיוחד של ECM, כונדרוציטים מוקפים בשכבה דקה של מטריצה מיוחדת המכונה מטריצה הפראיסלנדי lular (PCM). ה-PCM משמש ממשק מטריצות של מטריצת תאים1 המגן על כונדרוציטים2 ומודול התגובה הביוסינתטית שלהם3. כפי שתוארה בעבר4, ב סחוס בריא, כונדרוציטים מסודרים דפוסים ספציפיים, ברורים מרחביים, כי הם ספציפיים עבור כל שכבת רקמה משותף4,5 ותלוי במנגנון משותף ספציפי הטעינה מכני6. דפוסים אלה משתנים מזוגות ומיתרים בסחוס בריא כדי כפול מחרוזות עם תחילתה של אוסטיאוארתריטיס (OA). עם התקדמות נוספת של המחלה כונדרוציטים הטופס אשכולות קטנים, הגדלת בהדרגה בגודל לאשכולות גדולים OA מתקדם. אובדן מוחלט של כל מבנה ארגוני אינדוקציה של אפופטוזיס הוא נצפה בסוף השלב OA. כך, הסדר הסלולר כchondrocyte יכול לשמש כסמנים מבוססי תמונה עבור התקדמות OA4.
תכונות ביומכאניות של תאים ורקמות לא רק לווסת את צורתם ואת התפקוד אלא גם חיוני לשמירה על החיוניות שלהם. שינויים אלסטיות יכול להפיץ או להפעיל את תחילתה של מחלות גדולות כמו סרטן או OA. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) התפתחה ככלי רב-עוצמה לאפיון ולכימות המאפיינים הביומכאניות של מבני יעד ביולוגיים ספציפיים בקנה מידה מיקרוסקופי, מדידת מגוון רחב של כוח, מ piconewton ל מיקרוקטון. היישום העיקרי של AFM הוא למדוד את הטופוגרפיה פני השטח ותכונות מכניות של דגימות ברזולוציה subnanometer7. התקן המדידה כולל שלושה מרכיבים עיקריים: 1) בדיקה AFM, שהיא עצה חדה הנטענת על הזיז ומשמשת לאינטראקציה ישירה עם פני השטח של המדגם. כאשר הכוח מוחל על הזיז, העיוות של האחרון מתרחש על פי המאפיינים של רקמת נמדד. 2) מערכת אופטית המשעלת קרן לייזר על הזיז, המשתקף לאחר מכן ליחידת מגלאי. 3) גלאי פוטודיודה התופס את האור החוצה מהזיז. הוא ממיר את המידע שהתקבל על הסטה לייזר על ידי הזיז לתוך עקומת כוח שניתן לנתח.
לפיכך, העיקרון העיקרי של AFM הוא גילוי של הכוח הפועל בין הבדיקה AFM ואת מבנה היעד של המדגם. עקומות הכוח השיגו לתאר את התכונות המכאניות של מבני היעד על פני השטח לדוגמה כמו גמישות, הפצת הטעינה, מגנטיזציה, מתח התשואה, ואת עיוות פלסטיק אלסטי הדינמיקה8. יתרון חשוב של AFM על טכניקות דימות אחרות היא כי AFM ניתן להשתמש כדי למדוד את התכונות המכאניות של תאים חיים בינונית או רקמות במצב מקורי מבלי לפגוע ברקמה. AFM יכול לפעול הן בתנאי נוזלי או יבש. אין דרישה להכנה לדוגמא. AFM מספק את האפשרות לדמות דגימה ולמדוד את תכונותיו המכאניות בו זמנית בדגימות הסמוכות לתנאים פיזיולוגיים. במחקר הנוכחי אנו מתארים גישה הרומן להעריך התקדמות OA על ידי מדידת האלסטיות של ה-PCM ו ECM בסחוס מקורי המתאר. המתאם של הארגון המרחבי של כונדרוציטים עם מידת ניוון רקמות מקומיות מספק פרספקטיבה חדשה לחלוטין לגילוי מוקדם של OA. עם זאת, הרלוונטיות הפונקציונלית של תבניות אלה לא הוערכו עד כה. מכיוון שתפקידה העיקרי של הסחוס הראשי הוא טעינת הנושאת בחיכוך נמוך, הרקמה חייבת להיות בעל תכונות אלסטיים. AFM מאפשר למדוד לא רק את האלסטיות של ECM אלא גם של דפוסי הסלולר מרחבי מוטבע ב-PCM שלהם. המתאם הנצפה של אלסטיות עם שינוי דפוס מרחבי של כונדרוציטים הוא כל כך חזק מדידת אלסטיות לבד יכול לאפשר ריבוד של ניוון רקמות מקומיות.
אלסטי מודולים של ה-PCM ו ECM העריכו בסעיפים 35 μm-דק באמצעות מערכת AFM משולב לתוך מיקרוסקופ לעומת שלב הפוכה שאיפשר ויזואליזציה סימולטני של דגימת הסחוס. פרוטוקול זה מבוסס על מחקר כבר פורסם מהמעבדה שלנו9 ובמיוחד מתאר כיצד לאפיין את ההסדר המרחבי של כונדרוציטים וכיצד למדוד את האלסטיות של ה-PCM שלהם ו-ecm הקשורים. עם כל שינוי דפוס של כונדרוציטים, שינויים משמעותיים אלסטיות יכול גם להיות נצפתה הן PCM ו-ECM, המאפשר טכניקה זו כדי לשמש ישירות למדוד את השלב של ניוון של הסחוס.
גישה זו מאומתת פותחת דרך חדשה להערכת התקדמות OA והשפעות טיפוליות בשלבים המוקדמים לפני השפלה רקמות מאקרוסקופי למעשה מתחיל להופיע. ביצוע מדידות AFM באופן עקבי הוא תהליך מפרך. בפרוטוקול הבא נתאר כיצד להכין את המדגם שנמדד על ידי AFM, כיצד לבצע את מדידות AFM בפועל החל בהכנת הזיז, כיצד לכייל את ה-AFM, ולאחר מכן כיצד לבצע את המידות. הוראות שלב אחר שלב נותנות גישה ברורה ותמציתית כדי לקבל נתונים אמינים ולספק אסטרטגיות בסיסיות לעיבוד ולפענוח זה. סעיף הדיון מתאר גם את החסרונות הנפוצים ביותר של שיטה קפדנית זו ומספק עצות מועילות לפתרון בעיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
באמצעות AFM כטכניקה חדשנית ורבת עוצמה כדי למדוד את התכונות הביומכאניות של חומרים ביולוגיים ברמת ננו-סקאלה, מדדנו את התכונות האלסטיים של ECM ו-PCM בסחוס הגוף האנושי האוסטאופתית. דגימות סחוס נבחרו על פי דפוס מרחבית השולט שלהם של הארגון כchondrocyte כגון התמונה מבוססת ביואריקר עבור ניוון רקמות מקומיו…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למחברים שלנו מהפרסום המקורי לעזרתם ולתמיכתם.
Materials
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
Referências
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al. The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis. Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).
- Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production. Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).
- Polini, A., Yang, F., Ramalingam, M., Ramakrishna, S. Physicochemical characterization of nanofiber composites. Nanofiber Composites for Biomedical Applications. , 97-115 (2017).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis–I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).
- Choi, A. P., Zheng, Y. P. Estimation of Young’s modulus and Poisson’s ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect. Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).
- Jin, H., Lewis, J. L. Determination of Poisson’s ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).
