早期変形性関節症の検出に対する原子間力顕微鏡の応用
Summary
原子間力顕微鏡(AFM)を用いて関節軟骨における細胞レベルにおける変形性関節症の初期変化を調べる方法を紹介する。
Abstract
細胞や組織の生体力学的性質は、その形状や機能を調節するだけでなく、その活力を維持するためにも重要です。弾力性の変化は、癌や変形性関節症(OA)のような主要な疾患の発症を伝播または引き起こす可能性があります。原子間力顕微鏡(AFM)は、ピコニュートンと同じくらい小さい範囲からマイクロニュートンまでの範囲で、特定の生物学的標的構造の生体力学的特性を定量的かつ定量的に特徴付ける強力なツールとして登場しました。生体力学的特性は、高レベルの緊張を受ける筋骨格組織において特別に重要である。軟骨の変性疾患としてのOAは、細胞外マトリックス(ECM)に埋め込まれた軟骨細胞の細胞内マトリックス(PCM)の破壊および空間的再配置をもたらす。PCMおよびECMの破壊は軟骨の生体力学的特性の変化と関連している。本研究では、軟骨細胞の特定の空間パターン変化に関連して、これらの変化を定量化するためにAFMを用いた。各パターン変化に伴い、PCMとECMの両方に対して、弾力性の有意な変化が観察された。局所弾性を測定することで、OAにおける局所組織変性の程度について直接的な結論を導き出すことができます。
Introduction
関節軟骨は血管、神経組織である。まばらに散在した軟骨細胞は、それらが埋め込まれている広大な細胞外マトリックス(ECM)を産生し、組織し、維持する。ECMの明確で特殊な部分として、軟骨細胞は、細胞周囲マトリックス(PCM)として知られている特殊なマトリックスの薄い層に囲まれています。PCM は、軟骨細胞2を保護し、その生合成応答3を調節するメカノイセン症セルマトリックス インターフェース1として機能します。先に説明した4、健康軟骨において、軟骨細胞は、各組織層および関節44、55に特異的であり、関節特異的な機械的負荷機構6に依存する特定の、明確な空間パターンに配置される。これらのパターンは、健康な軟骨のペアと文字列から変形性関節症(OA)の発症を伴う二重弦に変化する。この疾患のさらなる進行に伴い、軟骨細胞は小さなクラスターを形成し、高度なOAでは大きなクラスターに徐々に大きなクラスターのサイズが増加する。組織構造の完全な損失とアポトーシスの誘導は、エンドステージOAで観察されます。これにより、軟骨細胞配列は、OA進行4の画像ベースバイオマーカーとして使用することができる。
細胞や組織の生体力学的性質は、その形状や機能を調節するだけでなく、その活力を維持するためにも重要です。弾力性の変化は、癌やOAのような主要な疾患の発症を伝播または引き起こす可能性があります。原子間力顕微鏡(AFM)は、ピコニュートンからミクロニュートンまで、幅広い力を測定する、特定の生物学的標的構造の生体力学的特性を定量的に定性的に特徴付ける強力なツールとして登場しました。AFMの主な応用は、サブナノメートルの分解能7でサンプルの表面地形と機械的特性を測定することです。測定装置は3つの主要な部品から成っている:1)AFMプローブは、片持ち面に取り付けられた鋭い先端であり、サンプルの表面との直接の相互作用に使用される。カンチレバーに力が加えられると、後者の変形は、測定された組織の特性に従って起こる。2)レーザービームをカンチレバーに投影し、検出器に反射する光学系。3)カンチレバーから偏向した光をキャッチするフォトダイオード検出器。カンチレバーによるレーザー偏向に関する受信情報を、解析可能な力曲線に変換します。
したがって、AFMの主な原理は、AFMプローブとサンプルの標的構造との間で作用する力の検出である。得られた力曲線は、弾性、電荷分布、磁化、降伏応力、弾性塑性変形力学8のようなサンプル表面上のターゲット構造の機械的特性を表す。AFMの他のイメージング技術に対する重要な利点は、AFMが、組織を損傷することなく、ネイティブ状態の培地または組織の生きた細胞の機械的特性を測定するために使用できることです。AFMは液体か乾燥した条件の両方で作動できる。サンプル準備の要件はありません。AFMは、標本を画像化し、生理学的条件に近い標本で同時にその機械的特性を測定する可能性を提供します。本研究では、ネイティブ関節軟骨におけるPCMおよびECMの弾性を測定することによってOAの進行を評価するための新しいアプローチを説明する。軟骨細胞の空間組織と局所組織変性の程度の相関は、OAの早期発見のための全く新しい視点を提供する。しかし、これらのパターンの機能的関連性は、今のところ評価されていません。関節軟骨の主要な機能は低摩擦での耐荷重であるため、組織は弾性特性を有する必要があります。AFMは、ECMの弾力性だけでなく、PCMに埋め込まれた空間セルラーパターンの測定も可能にします。軟骨細胞の空間パターン変化との弾力性の観察された相関関係は非常に強く、弾力性を測定するだけで局所組織変性の成層を可能にする可能性があります。
PCMとECMの弾性率は、軟骨サンプルの同時可視化を可能にする反転相コントラスト顕微鏡に統合されたAFMシステムを使用して、35μm薄いセクションで評価しました。このプロトコルは、我々の研究室9から既に発表された研究に基づいており、具体的には、軟骨細胞の空間的配置を特徴付ける方法と、それらの関連するPCMおよびECMの弾力性を測定する方法を記述する。軟骨細胞のパターン変化のたびに、PCMとECMの両方に対しても大きな弾力性の変化が観察され、この技術を使用して軟骨の変性の段階を直接測定することができます。
この検証されたアプローチは、巨視組織の分解が実際に現れ始める前に、初期段階でOAの進行と治療効果を評価する新しい方法を開きます。AFM測定を一貫して行うことは困難なプロセスです。以下のプロトコルでは、AFMによって測定されるサンプルを調製する方法、カンチレバーの調製から始まる実際のAFM測定を行う方法、AFMを較正する方法、および測定を行う方法について説明する。ステップバイステップの手順は、信頼性の高いデータを取得し、それを処理し、解釈するための基本的な戦略を提供するための明確で簡潔なアプローチを提供します。また、この厳格な方法の最も一般的な落とし穴についても説明し、トラブルシューティングのヒントも紹介します。
Protocol
Representative Results
Discussion
AFMをナノスケールレベルで生体材料の生体力学的特性を測定する新しい強力な技術として、ヒト変形性関節関節関節軟骨におけるECMおよびPCMの弾性特性を測定した。軟骨サンプルは、局所組織変性のための画像ベースのバイオマーカーとして軟骨細胞組織のそれらの主要な空間パターンに従って選択した。予想通り、空間軟骨細胞再編成に伴い、ECMとPCMの両方の弾性値の強い低下が見られた?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、彼らの助けとサポートのために元の出版物からの私たちの共同執筆者に感謝します。
Materials
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
Referências
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