조기 골관절염을 검출하기 위한 원자력 현미경 검사법 적용
Summary
우리는 원자력 현미경 검사법 (AFM)를 사용하여 관절 연골의 세포 수준에서 초기 골관절염 변화를 조사하는 방법을 제시합니다.
Abstract
세포와 조직의 생체 역학적 특성은 모양과 기능을 조절할 뿐만 아니라 활력을 유지하는 데에도 중요합니다. 탄력의 변화는 암이나 골관절염 (OA)과 같은 주요 질병의 발병을 전파하거나 유발할 수 있습니다. 원자력 현미경 검사법(AFM)은 피코뉴턴에서 마이크로뉴턴에 이르는 범위에서 측정력을 측정하는 미세한 스케일에서 특정 생물학적 표적 구조의 생체역학적 특성을 정성적및 정량적으로 특성화하는 강력한 도구로 부상했습니다. 생체 역학적 특성은 높은 수준의 변형을 받는 근골격계 조직에서 특히 중요합니다. 연골의 퇴행성 질환으로서 OA는 세포외 매트릭스(ECM)에 내장된 연골 세포의 세포질(PCM)과 공간 적 재배열의 중단을 초래한다. PCM 및 ECM의 붕괴는 연골의 생체 역학적 특성의 변화와 관련이 있습니다. 본 연구에서 우리는 연골 세포의 특정 공간 패턴 변화와 관련하여 이러한 변화를 정량화하기 위해 AFM을 사용했습니다. 각 패턴 변화에 따라 PCM 및 ECM 모두에 대해 탄성의 상당한 변화가 관찰되었습니다. 따라서 국소 탄성을 측정하면 OA에서 국소 조직 변성의 정도에 대한 직접적인 결론을 도출 할 수 있습니다.
Introduction
관절 연골은 혈관, 신경 조직입니다. 드물게 산란된 연골세포는 광대한 세포외 기종(ECM)을 생성, 구성 및 유지합니다. ECM의 뚜렷하고 전문화된 부분으로서, 연골세포는 pericellular 매트릭스 (PCM)로 알려져 있는 전문화한 매트릭스의 얇은 층으로 포위됩니다. PCM은 연골세포2를 보호하고 생합성 반응을 조절하는 메카노민성 세포 매트릭스 인터페이스1의 역할을 한다3. 앞서 설명한바와 같이,건강한 연골에서, 연골세포는 각 조직층 및 관절4,,5에 특이적이고 관절 특이적 기계적 로딩 메커니즘에 의존하는 특이적이고 뚜렷한 공간 패턴으로 배열된다6. 이러한 패턴은 건강한 연골의 쌍과 문자열에서 골관절염 (OA)의 발병과 함께 이중 문자열로 변경됩니다. 질병의 추가 진행과 함께 연골 세포는 작은 클러스터를 형성하고 고급 OA에서 큰 클러스터로 점차 크기가 증가합니다. 모든 조직 구조의 완전한 손실과 사멸의 유도는 최종 단계 OA에서 관찰됩니다. 따라서, 연골세포 세포 배열은 OA 진행에 대한 이미지 기반 바이오마커로서 사용될 수있다 4.
세포와 조직의 생체 역학적 특성은 모양과 기능을 조절할 뿐만 아니라 활력을 유지하는 데에도 중요합니다. 탄력성의 변화는 암이나 OA와 같은 주요 질병의 발병을 전파하거나 유발할 수 있습니다. 원자력 현미경 검사법(AFM)은 피코뉴턴에서 마이크로뉴턴에 이르는 광범위한 힘을 측정하는 현미경 규모의 특정 생물학적 표적 구조의 생체역학적 특성을 정성적및 정량적으로 특성화하는 강력한 도구로 부상했습니다. AFM의 주요 응용 프로그램은 서브 나노 미터 해상도7에서샘플의 표면 지형 및 기계적 특성을 측정하는 것입니다. 측정 장치는 세 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다: 1) 캔틸레버에 장착된 날카로운 팁이며 시료 표면과 직접 상호 작용하는 데 사용되는 AFM 프로브. 힘이 캔틸레버에 가해지면 측정 된 조직의 특성에 따라 후자의 변형이 발생합니다. 2) 레이저 빔을 캔틸레버에 투사한 다음 검출기 장치에 반사되는 광학 시스템입니다. 3) 캔틸레버에서 반사된 빛을 포착하는 포토다이오드 검출기입니다. 캔틸레버에 의한 레이저 편향에 관한 수신된 정보를 분석할 수 있는 힘 곡선으로 변환합니다.
따라서, AFM의 주요 원리는 AFM 프로브와 샘플의 표적 구조 사이에서 작용하는 힘의 검출이다. 얻어진 힘 곡선은 탄성, 전하 분포, 자화, 항복 응력 및 탄성 소성 변형 역학8과같이 샘플 표면에 대상 구조의 기계적 특성을 설명합니다. 다른 이미징 기술에 비해 AFM의 중요한 장점은 AFM이 조직을 손상시키지 않고 기본 상태에서 중간 또는 조직에서 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정하는 데 사용될 수 있다는 것입니다. AFM은 액체 또는 건조 조건에서 모두 작동 할 수 있습니다. 샘플 준비에 대한 요구 사항은 없습니다. AFM은 생리적 조건에 가까운 표본에서 동시에 시편을 이미지화하고 기계적 특성을 측정할 수 있는 가능성을 제공합니다. 본 연구에서 우리는 네이티브 관절 연골에서 PCM 및 ECM의 탄성을 측정하여 OA 진행을 평가하는 새로운 접근법을 설명합니다. 국소 조직 변성의 정도와 연골 세포의 공간 조직의 상관 관계는 OA의 조기 발견을위한 완전히 새로운 관점을 제공합니다. 그러나 이러한 패턴의 기능적 관련성은 지금까지 평가되지 않았습니다. 관절 연골의 주요 기능은 낮은 마찰에서 부하 베어링이기 때문에, 조직은 탄성 특성을 가지고 있어야합니다. AFM은 ECM의 탄성뿐만 아니라 PCM에 내장된 공간 셀룰러 패턴을 측정할 수 있습니다. 연골 세포의 공간 패턴 변화와 탄성의 관찰 상관 관계는 탄성을 측정하는 것만으로국부 조직 변성의 계층화를 허용할 수 있도록 강하다.
PCM 및 ECM의 탄성 계수는 연골 샘플의 동시 시각화를 허용하는 반전된 상 대비 현미경에 통합된 AFM 시스템을 사용하여 35 μm-thin 섹션에서 평가하였다. 이 프로토콜은 이미 우리의 실험실9에서 간행된 연구 결과에 근거를 두고 및 특히 연골 세포의 공간 배열을 특성화하는 방법과 관련 PCM 및 ECM의 탄성을 측정하는 방법을 기술합니다. 연골 세포의 각 패턴 변화와 함께, 탄성의 중요한 변화는 또한 PCM과 ECM 모두에 대해 관찰 될 수있다, 이 기술은 직접 연골의 변성 단계를 측정하는 데 사용할 수 있도록.
이 검증된 접근은 거시적인 조직 분해가 실제로 나타나기 시작하기 전에 초기 단계에서 OA 진행 및 치료 효력을 평가하는 새로운 쪽을 엽니다. AFM 측정을 일관되게 수행하는 것은 힘든 과정입니다. 다음 프로토콜에서는 AFM에 의해 측정될 샘플을 준비하는 방법, 캔틸레버 의 준비로 시작하는 실제 AFM 측정을 수행하는 방법, AFM을 교정하는 방법 및 측정을 수행하는 방법을 설명합니다. 단계별 지침은 신뢰할 수 있는 데이터를 가져오고 이를 처리하고 해석하기 위한 기본 전략을 제공하기 위한 명확하고 간결한 접근 방식을 제공합니다. 또한 토론 섹션에서는 이 엄격한 방법의 가장 일반적인 함정에 대해 설명하고 유용한 문제 해결 팁을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
나노 수준에서 생물학적 물질의 생체 역학적 특성을 측정하는 신규하고 강력한 기술로 AFM을 사용하여, 우리는 인간의 골관절염 관절 연골에서 ECM 및 PCM의 탄성 특성을 측정했다. 연골 샘플은 국부 조직 변성을 위한 이미지 기반 바이오마커로서 연골세포 조직의 그들의 우세한 공간 패턴에 따라 선택되었다. 예상대로, ECM 및 PCM 모두의 탄성값의 강한 하락은 공간 연골세포 재구성을 따라 관찰되었?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그들의 도움과 지원에 대한 원래 출판물에서 우리의 공동 저자에게 감사드립니다.
Materials
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
Referências
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