Tillämpning av Atomkraft mikroskopi för att upptäcka tidig artros
Summary
Vi presenterar en metod för att undersöka tidiga artrosförändringar på cellnivå i ledbrosk med hjälp av atomkraftmikroskopi (AFM).
Abstract
Biomekaniska egenskaper hos celler och vävnader inte bara reglera deras form och funktion, men är också avgörande för att upprätthålla deras vitalitet. Förändringar i elasticitet kan propagera eller utlösa uppkomsten av stora sjukdomar som cancer eller artros (OA). Atomkraftmikroskopi (AFM) har vuxit fram som ett starkt verktyg för att kvalitativt och kvantitativt karakterisera biomekaniska egenskaper specifika biologiska målstrukturer på mikroskopisk skala, mäta krafter i ett intervall från så liten som piconewton till mikronewton. Biomekaniska egenskaper är av särskild betydelse i muskuloskeletala vävnader, som utsätts för höga nivåer av stam. OA som en degenerativ sjukdom i brosket resulterar i störningar av pericellular matris (PCM) och den rumsliga omorganisering av kondrocyter inbäddade i deras extracellulära matris (ECM). Störningar i PCM och ECM har associerats med förändringar i de biomekaniska egenskaperna hos brosk. I den aktuella studien använde vi AFM för att kvantifiera dessa förändringar i förhållande till de specifika rumsliga mönsterförändringar av kondrocyterna. Med varje mönster förändring observerades betydande förändringar i elasticitet för både PCM och ECM. Mätning av den lokala elasticiteten gör det möjligt att dra direkta slutsatser om graden av lokal vävnadsdegeneration i OA.
Introduction
Ledbrosk är en avaskulär, aneural vävnad. Glest spridda kondrocyter producerar, organiserar och underhåller en expansiv extracellulär matris (ECM) som de är inbäddade i. Som en distinkt och specialiserad del av ECM, kondrocyter är omgivna av ett tunt lager av specialiserade matris kallas pericellular matris (PCM). PCM fungerar som en mekanosensitive cell-matris gränssnitt1 som skyddar kondrocyterna2 och modulerar deras biosyntetiska svar3. Som tidigare beskrivits4, i friska brosk, kondrocyter är ordnade i specifika, distinkta rumsliga mönster som är specifika för varje vävnad skikt och gemensamma4,,5 och beror på gemensamma specifika mekaniska lastmekanismer6. Dessa mönster ändras från par och strängar i friska brosk till dubbla strängar med uppkomsten av artros (OA). Med ytterligare progression av sjukdomen bildar kondrocyterna små kluster, ökar gradvis i storlek till stora kluster i avancerade OA. En fullständig förlust av någon organisationsstruktur och induktion av apoptos observeras i slutet skede OA. Således kan chondrocyte cellulära arrangemang användas som en bildbaserad biomarkör för OA progression4.
Biomekaniska egenskaper hos celler och vävnader inte bara reglera deras form och funktion, men är också avgörande för att upprätthålla deras vitalitet. Förändringar i elasticitet kan propagera eller utlösa uppkomsten av stora sjukdomar som cancer eller OA. Atomkraftmikroskopi (AFM) har vuxit fram som ett kraftfullt verktyg för att kvalitativt och kvantitativt karakterisera biomekaniska egenskaper specifika biologiska målstrukturer på mikroskopisk skala, mäta ett brett spektrum av kraft, från piconewton till mikronewton. Den viktigaste tillämpningen av AFM är att mäta yt topografi och mekaniska egenskaper av prover vid subnanometer upplösning7. Mätanordningen består av tre huvudkomponenter: 1) En AFM-sond, som är en vass spets monterad på en cantilever och används för direkt interaktion med provets yta. När kraft appliceras på fribärande, sker deformation av den senare enligt den uppmätta vävnadens egenskaper. 2) Ett optiskt system som projicerar en laserstråle på cantilever, som sedan reflekteras till en detektor enhet. 3) En fotodiod detektor som fångar ljuset avledas från cantilever. Den omvandlar den mottagna informationen om laseravböjningen av cantilever till en kraftkurva som kan analyseras.
Huvudprincipen för afm är således detektion av den kraft som verkar mellan AFM-sonden och provets målstruktur. De kraftkurvor som erhålls beskriver målstrukturernas mekaniska egenskaper på provytan som elasticitet, laddningsfördelning, magnetisering, avkastningsstrus och elastisk plastdeformationsdynamik8. En viktig fördel med AFM jämfört med andra bildframställningstekniker är att AFM kan användas för att mäta de mekaniska egenskaperna hos levande celler i medium eller vävnader i ett inbyggt tillstånd utan att skada vävnaden. AFM kan fungera både i flytande eller torra förhållanden. Det finns inget krav på provberedning. AFM ger möjlighet att avbilda ett prov och mäta dess mekaniska egenskaper samtidigt i prover som är nära fysiologiska förhållanden. I denna studie beskriver vi en ny metod för att bedöma OA progression genom att mäta elasticiteten i PCM och ECM i inhemska ledbrosk. Korrelationen mellan rumsliga organisation av kondrocyter med graden av lokal vävnaddegeneration ger ett helt nytt perspektiv för tidig upptäckt av OA. Den funktionella relevansen av dessa mönster har dock inte utvärderats hittills. Eftersom den viktigaste funktionen av ledbrosket är bärande vid låg friktion, måste vävnaden ha elastiska egenskaper. AFM gör det möjligt att mäta inte bara e-elasticiteten i ECM utan också av de rumsliga cellulära mönster inbäddade i deras PCM. Den observerade korrelationen av elasticitet med rumsliga mönster förändring av kondrocyterna är så stark att mäta elasticitet ensam kan tillåta stratifiering av lokala vävnad degeneration.
Elastisk moduli av PCM och ECM bedömdes i 35 μm tunna sektioner med hjälp av ett AFM-system integrerat i en inverterad fas kontrast mikroskop som tillät samtidig visualisering av brosk provet. Detta protokoll bygger på en studie som redan publicerats från vårt laboratorium9 och specifikt beskriver hur man karakteriserar den rumsliga arrangemang av kondrocyter och hur man mäter elasticiteten i deras associerade PCM och ECM. Med varje mönsterförändring av kondrocyterna kan betydande förändringar i elasticitet också observeras för både PCM och ECM, vilket gör att denna teknik kan användas för att direkt mäta degenerationsstadiet.
Denna validerade metod öppnar ett nytt sätt att utvärdera OA progression och terapeutiska effekter i ett tidigt skede innan makroskopiska vävnad nedbrytning faktiskt börjar visas. Utföra AFM mätningar konsekvent är en mödosam process. I följande protokoll beskriver vi hur man förbereder provet som ska mätas med AFM, hur man utför de faktiska AFM-mätningarna som börjar med beredning av cantilever, hur man kalibrerar AFM och sedan hur mätningarna ska utföras. Steg-för-steg-instruktioner ger en tydlig och koncis metod för att få tillförlitliga data och tillhandahålla grundläggande strategier för bearbetning och tolkning av dem. I diskussionsavsnittet beskrivs också de vanligaste fallgroparna för den här rigorösa metoden och användbara felsökningstips.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med AFM som en ny och kraftfull teknik för att mäta biomekaniska egenskaper biologiska material på nanoskala nivå, mätte vi de elastiska egenskaperna hos ECM och PCM i mänskliga osteoartros ledbrosk. Brosk prover valdes enligt deras dominerande rumsliga mönster av kondrocyte organisation som en bild-baserade biomarkör för lokala vävnad degeneration. Som väntat observerades en stark nedgång i värdena för elasticitet hos både ECM och PCM längs rumsliga kondrocyt omorganisation. Dessa observationer belyser t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar våra medförfattare från den ursprungliga publikationen för deras hjälp och stöd.
Materials
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
Referências
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al. The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis. Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).
- Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production. Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).
- Polini, A., Yang, F., Ramalingam, M., Ramakrishna, S. Physicochemical characterization of nanofiber composites. Nanofiber Composites for Biomedical Applications. , 97-115 (2017).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis–I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).
- Choi, A. P., Zheng, Y. P. Estimation of Young’s modulus and Poisson’s ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect. Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).
- Jin, H., Lewis, J. L. Determination of Poisson’s ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).
