Erken Osteoartrit tespit etmek için Atomik Kuvvet Mikroskobu Uygulaması
Summary
Biz atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak eklem kıkırdağı hücresel düzeyde erken osteoartritik değişiklikleri araştırmak için bir yöntem saklıt.
Abstract
Hücrelerin ve dokuların biyomekanik özellikleri sadece şekil ve işlevlerini düzenlemekle kalmamış, aynı zamanda canlılıklarını korumak için de çok önemlidir. Elastikiyet değişiklikleri yaymak veya kanser veya osteoartrit gibi büyük hastalıkların başlangıcı tetikleyebilir (OA). Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), belirli biyolojik hedef yapıların biyomekanik özelliklerini mikroskobik ölçekte nitel ve nicel olarak karakterize etmek için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmış ve pikonewton’dan mikronewtona kadar olan bir aralıktaki kuvvetleri ölçmüştür. Biyomekanik özellikler, yüksek düzeyde gerilmeye maruz kalan kas-iskelet dokularında özel öneme sahiptir. Kıkırdağın dejeneratif bir hastalığı olarak OA perisellüler matriks bozulması na neden olur (PCM) ve kondrositlerin uzaysal yeniden düzenlenmesi onların ekstrasellüler matriks gömülü (ECM). PCM ve ECM’deki bozulma, kıkırdağın biyomekanik özelliklerindeki değişikliklerle ilişkilendirilmiştir. Bu çalışmada kondrositlerin spesifik uzamsal desen değişiklikleri ile ilgili olarak bu değişiklikleri ölçmek için AFM kullanılır. Her desen değişiminde hem PCM hem de ECM için elastikiyette önemli değişiklikler gözlendi. Böylece yerel elastikiyetin ölçülmesi, OA’daki lokal doku dejenerasyonunun derecesi hakkında doğrudan sonuçlar alabına olanak sağlar.
Introduction
Eklem kıkırdağı avasküler, aneural dokudur. Seyrek dağınık kondrositler, gömülü oldukları geniş bir hücre dışı matris (ECM) üretir, düzenler ve korur. ECM’nin farklı ve özel bir parçası olarak kondrositler perisellüler matriks (PCM) olarak bilinen ince bir özel matris tabakası ile çevrilidir. PCM kondrositler korur bir mekanosensitive hücre-matris arayüzü1 olarak görür2 ve biyosentetik tepki modüle3. Daha önce açıklandığı gibi4, sağlıklı kıkırdak, kondrositler her doku tabakası ve eklemiçinözel olan belirli, farklı mekansal desenler düzenlenmiştir4 ,5 ve eklem özgü mekanik yükleme mekanizmaları bağlıdır6. Bu desenler osteoartrit başlangıcı ile çift dizeleri sağlıklı kıkırdak çiftleri ve dizeleri değiştirmek (OA). Hastalığın daha da ilerlemesi ile kondrositler küçük kümeler oluştururlar, boyutu giderek artan büyük OA. Son evre OA’da herhangi bir organizasyon yapısının tamamen kaybedilmesi ve apoptozin indüksiyonu gözlenmektedir. Böylece, kondrosit hücresel düzenleme OA ilerlemesi için görüntü tabanlı biyomarker olarak kullanılabilir4.
Hücrelerin ve dokuların biyomekanik özellikleri sadece şekil ve işlevlerini düzenlemekle kalmamış, aynı zamanda canlılıklarını korumak için de çok önemlidir. Elastikiyet değişiklikleri yaymak veya kanser veya OA gibi büyük hastalıkların başlangıcı tetikleyebilir. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), pikonewton’dan mikronewton’a kadar çok çeşitli kuvvetleri ölçen, belirli biyolojik hedef yapıların biyomekanik özelliklerini mikroskobik ölçekte niteliksel ve nicel olarak karakterize eden güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. AFM’nin en önemli uygulaması, numunelerin yüzey topografyasını ve mekanik özelliklerini nanometre çözünürlüğünde ölçmektir7. Ölçüm cihazı üç ana bileşenden oluşur: 1) Bir kantilin üzerine monte edilmiş keskin bir uç olan ve numunenin yüzeyi ile doğrudan etkileşim için kullanılan bir AFM probu. Kantile kuvvet uygulandığında, ölçülen dokunun özelliklerine göre ikincisinin deformasyonu oluşur. 2) Bir optik sistem daha sonra bir dedektör ünitesine yansıtılır cantilever üzerine bir lazer ışını projeleri. 3) Kantilden sapmış ışığı yakalayan bir fotodiyot dedektörü. Kantilever tarafından lazer sapması ile ilgili alınan bilgileri analiz edilebilen bir kuvvet eğrisine dönüştürür.
Bu nedenle, AFM’nin temel prensibi, AFM sondası ile numunenin hedef yapısı arasında hareket eden kuvvetin saptanmasıdır. Elde edilen kuvvet eğrileri elastikiyet, şarj dağılımı, manyetizasyon, verim gerilimi ve elastik plastik8deformasyon dinamiği 8 gibi örnek yüzeyinde hedef yapıların mekanik özelliklerini tanımlar. AFM’nin diğer görüntüleme tekniklerine göre önemli bir avantajı, AFM’nin dokuya zarar vermeden ortam veya dokularda yaşayan hücrelerin mekanik özelliklerini ölçmek için kullanılabilmedir. AFM hem sıvı hem de kuru koşullarda çalışabilir. Numune hazırlama için bir gereklilik yoktur. AFM, fizyolojik koşullara yakın numunelerde bir numunenin görüntülenebilme ve mekanik özelliklerini aynı anda ölçme olanağı sağlar. Bu çalışmada, yerli eklem kıkırdağında PCM ve ECM’nin elastikiyetini ölçerek OA ilerlemesini değerlendirmek için yeni bir yaklaşım açıklanmıştır. Kondrositlerin mekansal organizasyonunun lokal doku dejenerasyonu derecesi ile korelasyonoa erken teşhisi için tamamen yeni bir bakış açısı sağlar. Ancak bu desenlerin işlevsel önemi şimdiye kadar değerlendirilmemiştir. Eklem kıkırdağının en önemli işlevi düşük sürtünmede yük taşıma olduğundan, doku elastik özelliklere sahip olmalıdır. AFM, sadece ECM’nin elastikiyetinin değil, pcm’lerine gömülü uzamsal hücresel desenlerin de ölçülmesine olanak tanır. Elastikiyetin kondrositlerin mekansal desen değişimi ile gözlenen korelasyon o kadar güçlüdür ki, elastikiyetin tek başına ölçülmesi yerel doku dejenerasyonunun tabakalaşmasına izin verebilir.
PCM ve ECM’nin elastik modüllü leri, kıkırdak örneğinin eşzamanlı olarak görüntülenmesine olanak sağlayan ters faz kontrast mikroskobuna entegre edilmiş bir AFM sistemi kullanılarak 35 m inceliğindeki bölümlerde değerlendirildi. Bu protokol zaten bizim laboratuvar9 yayınlanan bir çalışma dayanmaktadır ve özellikle nasıl kondrositlerin mekansal düzenleme karakterize ve nasıl ilişkili PCM ve ECM elastikiyetini ölçmek için açıklar. Kondrositlerin her desen değişikliği ile, elastikiyet önemli değişiklikler de PCM ve ECM için görülebilir, bu teknik doğrudan kıkırdak dejenerasyon usahneyi ölçmek için kullanılmak üzere izin.
Bu doğrulanmış yaklaşım makroskopik doku bozulması aslında görünmeye başlamadan önce erken aşamalarında OA ilerleme ve terapötik etkileri değerlendirmek için yeni bir yol açılır. AFM ölçümlerini tutarlı bir şekilde gerçekleştirmek zorlu bir işlemdir. Aşağıdaki protokolde, AFM ile ölçülecek numunenin nasıl hazırlanacağı, cantilever’in hazırlanmasından başlayarak gerçek AFM ölçümlerinin nasıl yapılacılırılacılamının yapılabildiği, AFM’ nin nasıl kalibre edilen ve ölçümlerin nasıl yapılacıla Adım adım talimatlar, güvenilir veriler elde etmek ve işleme ve yorumlama için temel stratejiler sağlamak için açık ve öz bir yaklaşım sağlar. Tartışma bölümü ayrıca bu titiz yöntemin en yaygın tuzaklarını açıklar ve yararlı sorun giderme ipuçları sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biyolojik malzemelerin biyomekanik özelliklerini nano ölçekte ölçmek için yeni ve güçlü bir teknik olarak AFM’yi kullanarak, insan osteoartritik eklem kıkırdağındaki ECM ve PCM’nin elastik özelliklerini ölçtük. Kıkırdak örnekleri kondrosit organizasyonunun baskın uzamsal desenine göre yerel doku dejenerasyonu için görüntü tabanlı biyomarker olarak seçilmiştir. Beklendiği gibi, mekansal kondrosit yeniden düzenlenmesi boyunca hem ECM hem de PCM elastikiyet değerlerinde güçlü bir düşüş…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yardım ve destek için orijinal yayın bizim co-yazarlar teşekkür ederiz.
Materials
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
Referências
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al. The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis. Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).
- Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production. Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).
- Polini, A., Yang, F., Ramalingam, M., Ramakrishna, S. Physicochemical characterization of nanofiber composites. Nanofiber Composites for Biomedical Applications. , 97-115 (2017).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis–I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).
- Choi, A. P., Zheng, Y. P. Estimation of Young’s modulus and Poisson’s ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect. Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).
- Jin, H., Lewis, J. L. Determination of Poisson’s ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).
