مضاعفة في Electroporation الرحمية لاستهداف مجموعات الخلايا المنفصلة زمانياً ومكانياً
Summary
مضاعفة في الكهربائي الرحم يسمح استهداف مجموعات الخلايا التي يتم فصل مكاني وزمنيا. هذه التقنية مفيدة لتصور التفاعلات بين تلك الخلايا التي تستخدم البروتينات الفلورية في الظروف العادية ولكن أيضا بعد التجارب الوظيفية ل الجينات التي تثير الاهتمام.
Abstract
في الإلكتروبور الرحمي هو في تقنية نقل الحمض النووي في الجسم الحي تستخدم على نطاق واسع لدراسة الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة في الثدييات corticogenesis. يستفيد هذا الإجراء من بطين الدماغ للسماح بإدخال الحمض النووي ذات الاهتمام ويستخدم زوجًا من الأقطاب لتوجيه مدخل المادة الوراثية إلى الخلايا المبطنة للبطين ، وهي الخلايا الجذعية العصبية. هذه الطريقة تسمح للباحثين لتسمية الخلايا المطلوبة و / أو التلاعب في التعبير عن الجينات من الاهتمام في تلك الخلايا. لديها تطبيقات متعددة، بما في ذلك المقايسات التي تستهدف الهجرة العصبية، وتتبع النسب، ومحور عصبي المسار. ومن السمات الهامة لهذه الطريقة هي سيطرتها الزمنية والإقليمية، مما يسمح بالتحايل على المشاكل المحتملة المتعلقة بالفتاكة الجنينية أو عدم وجود فئران محددة من فئران سائق CRE. جانب آخر ذو صلة من هذه التقنية هو أنه يساعد على الحد إلى حد كبير من القيود الاقتصادية والزمنية التي تنطوي على توليد خطوط الماوس الجديدة ، والتي تصبح ذات أهمية خاصة في دراسة التفاعلات بين أنواع الخلايا التي تنشأ في مناطق بعيدة من الدماغ في مختلف الأعمار التنموية. هنا نحن وصف استراتيجية مزدوجة الكهربائي التي تمكن من استهداف مجموعات الخلايا التي يتم فصل مكاني وزمنيا. مع هذا النهج يمكننا تسمية أنواع فرعية مختلفة من الخلايا في مواقع مختلفة مع البروتينات الفلورية المختارة لتصور لهم، و / أو يمكننا التعامل مع الجينات من الفائدة التي تعبر عنها هذه الخلايا المختلفة في الأوقات المناسبة. هذه الاستراتيجية تعزز إمكانات في الصعق الكهربائي الرحمي وتوفر أداة قوية لدراسة سلوك مجموعات الخلايا المنفصلة زمانياً ومكانياً التي تهاجر لإقامة اتصالات وثيقة، فضلاً عن التفاعلات طويلة المدى من خلال الإسقاطات المحورية، مما يقلل من التكاليف الزمنية والاقتصادية.
Introduction
القشرة الدماغية هي بنية معقدة جدا ومنظمة بشكل معقد. لتحقيق هذه الدرجة من التنظيم، الخلايا العصبية إسقاط القشرية تمر العمليات التنموية المعقدة التي تتطلب جيلها الزمني، والهجرة إلى وجهتها النهائية في لوحة القشرية، وإنشاء اتصالات قصيرة وطويلة المدى1،,2. لفترة طويلة، كانت الطريقة الكلاسيكية لدراسة الكورتيوجينسيس على أساس استخدام نماذج الميرين بالضربة القاضية أو الروبوت في الجينات ذات الأهمية. ومع ذلك، هذه الاستراتيجية، وخاصة استخدام الفئران خروج المغلوب المشروطة، هو مضيعة للوقت ومكلفة، وأحيانا يطرح مشاكل إضافية بشأن وجود التكرار الوراثي أو عدم وجود برامج محددة CRE، من بين أمور أخرى. واحدة من النهج التي نشأت في محاولة لمعالجة تلك المشاكل ، وهذا يستخدم في الوقت الحاضر على نطاق واسع لدراسة التنمية القشرية هو في التيار الكهربائي الرحمي3،4. في الإلكتروبور الرحمي هو تقنية تستخدم في التنظير الجسدي، مما يسمح في الجسم الحي استهداف الخلايا الجذعية العصبية وذريتها. يمكن استخدام هذه الطريقة لتسمية الخلايا من خلال التعبير عن البروتينات الفلورية5،6، للتلاعب الجيني في الجسم الحي (أي كسب أو فقدان مقايسات الدالة)7،8،9، لعزل الكورتيسيسات الكهربائية في المختبر وخلايا الاستزراع8،10. وعلاوة على ذلك، يسمح الإكتروليت في الرحم بالسيطرة الزمنية والإقليمية على المنطقة المستهدفة. هذه التقنية لديها العديد من التطبيقات، وقد استخدمت على نطاق واسع لدراسة الهجرة العصبية, تقسيم الخلايا الجذعية, اتصال الخلايا العصبية, وغيرها من المواضيع8,,9,,11,,12.
تصف المخطوطة الحالية استخدام متغير كهربائي في الرحم، يُطلق عليه مضاعفة في الإلكتروبور الرحمي، لتحليل تفاعلات الخلايا في قشرة الدماغ ذات الأصول الزمانية والمكانية المختلفة. هذه الدراسات معقدة للغاية لإكمال عند استخدام نماذج المورين لأنها تتطلب الاستخدام المشترك لعدة خطوط محورة وراثيا. وتشمل بعض تطبيقات البروتوكول الموصوفة في هذه الورقة دراسة التفاعلات الوثيقة بين الخلايا المجاورة، فضلا عن التفاعلات بين الخلايا البعيدة من خلال الإسقاطات بعيدة المدى. تتطلب الطريقة إجراء اثنين مستقلين في عمليات الجراحة الكهربائية الرحمية ، مفصولة زمنيًا ومكانيًا ، على نفس الأجنة لاستهداف مجموعات الخلايا المختلفة ذات الاهتمام. وميزة هذا النهج هو إمكانية التلاعب وظيفة الجينات في واحد أو كلا النوعين من الخلايا العصبية باستخدام الحيوانات من النوع البرية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين هذه التجارب الوظيفية مع التعبير عن البروتينات الفلورية السيتوبلازمية أو الغشاء الموسومة لتصور مورفولوجيا الدقيقة للخلايا المستهدفة، بما في ذلك dendrites والمحارب، وتحليل الاختلافات المحتملة في التفاعلات الخلوية بالمقارنة مع السيطرة (أي الخلايا التي تحمل اسم البروتين الفلوري فقط).
ويركز البروتوكول المحدد هنا على دراسة التفاعلات الخلوية داخل القشرة الجديدة، ولكن هذه الاستراتيجية يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة التفاعلات مع المناطق الخارجة عن القشرية التي يمكن استهدافها باستخدام في الإلكتروبورات الرحمية، مثل الزبالة الفرعية أو المهاد13،,14،أو تفاعلات الخلايا في الهياكل الأخرى، مثل المخيخ15. ويستند استهداف مناطق مختلفة على اتجاه الأقطاب وعلى البطين حيث يتم حقن الحمض النووي (الجانبي، الثالث، أو الرابع). مع الاستراتيجية المذكورة هنا ، يمكننا تسمية عدد كبير من الخلايا ، وهو أمر مفيد لتقييم التغييرات العامة في الاتصال / التداخل في التجارب الوظيفية. ومع ذلك، لدراسة التغيرات الدقيقة في الاتصال، يمكن للمرء استخدام الإصدارات المعدلة من في الكهربائي الرحم للحصول على وضع العلامات sparser وتحديد خلايا واحدة16. وباختصار، فإن ضعف القدرة الكهربائية الرحمية هو طريقة متعددة الاستخدامات تسمح باستهداف مجموعات الخلايا المنفصلة زمانياً ومكانياً ودراسة تفاعلاتها بالتفصيل، إما في ظروف التحكم أو في ظروف مقترنة بتجارب وظيفية، مما يقلل إلى حد كبير من التكاليف الزمنية والاقتصادية.
Protocol
Representative Results
Discussion
دراسة التفاعلات الخلية الخلية في الجسم الحي في المناطق ذات الكثافة الخلوية العالية مثل قشرة الدماغ مهمة معقدة. النهج التقليدية بما في ذلك استخدام الأجسام المضادة لتسمية نيوريت ليست مناسبة بسبب عدم وجود علامات محددة للسكان الخلايا المختلفة. استخدام نماذج مورين المعدلة وراثيا، حيث نوع مع?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفان كريستينا أندريس كاربونيل وأعضاء مرفق العناية بالحيوانات التابع جامعة فالنسيا على المساعدة التقنية. كما نود أن نشكر إيزابيل فارينايس وساكرامنتو ر. فيرون على الكواشف وتبادل معداتها معنا. يتم تمويل I.M.W من خلال عقد Garantía Juvenil من Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221) ، يتم تمويل D.dA.D من قبل وزير دي سيسيليا ، Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz حاصل على منحة رامون إي كاجل (RYC-2015-19058) من وزير الإسبانية دي سينسيا، Innovación y Universidades (MICINN). تم تمويل هذا العمل RYC-2015-19058 و SAF2017-82880-R (MICINN).
Materials
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System – 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System – Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
Referências
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologia do Desenvolvimento. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurociência. 103, 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
- Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
- Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
- Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
- Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
- Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Biologia do Desenvolvimento. 322, 345-354 (2008).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).
- Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
- Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
- Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
- Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
- Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
- Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
- Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
- Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
- Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).
- DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).
- Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).
