Dubbel in utero-elektroporatie om tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties te targeten
Summary
Dubbel in utero elektroporatie maakt het richten van celpopulaties die ruimtelijk en tijdelijk gescheiden. Deze techniek is nuttig om interacties tussen die celpopulaties te visualiseren met behulp van fluorescerende eiwitten in normale omstandigheden, maar ook na functionele experimenten om genen van belang te verstoren.
Abstract
In utero elektroporatie is een in vivo DNA-overdracht techniek op grote schaal gebruikt om de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan zoogdier corticogenese te bestuderen. Deze procedure maakt gebruik van de hersenventrikels om de introductie van DNA van belang mogelijk te maken en maakt gebruik van een paar elektroden om de ingang van het genetisch materiaal in de cellen langs de ventrikel, de neurale stamcellen, te leiden. Deze methode stelt onderzoekers in staat om de gewenste cellen te labelen en/of de expressie van genen van belang in die cellen te manipuleren. Het heeft meerdere toepassingen, waaronder tests gericht op neuronale migratie, lineage tracing, en axonale pathfinding. Een belangrijk kenmerk van deze methode is de temporele en regionale controle, waardoor het omzeilen van mogelijke problemen in verband met embryonale dodelijkheid of het ontbreken van specifieke CRE-bestuurdersmuizen mogelijk is. Een ander relevant aspect van deze techniek is dat het helpt om de economische en temporele beperkingen die het genereren van nieuwe muislijnen te betrekken aanzienlijk verminderen, die bijzonder belangrijk worden in de studie van interacties tussen celtypen die afkomstig zijn uit verre gebieden van de hersenen op verschillende ontwikkelingsleeftijden. Hier beschrijven we een dubbele elektroporatiestrategie die het mogelijk maakt om celpopulaties te targeten die ruimtelijk en tijdelijk gescheiden zijn. Met deze aanpak kunnen we verschillende subtypes van cellen op verschillende locaties labelen met geselecteerde fluorescerende eiwitten om ze te visualiseren, en/of we kunnen genen van belang manipuleren die door deze verschillende cellen op de juiste tijdstippen worden uitgedrukt. Deze strategie verbetert het potentieel van in utero elektroporatie en biedt een krachtig hulpmiddel om het gedrag van tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties te bestuderen die migreren om nauwe contacten te leggen, evenals lange-afstandsinteracties door middel van axonale projecties, waardoor de temporele en economische kosten worden verminderd.
Introduction
De hersenschors is een zeer complexe en ingewikkeld georganiseerde structuur. Om een dergelijke mate van organisatie te bereiken, corticale projectie neuronen gaan door middel van complexe ontwikkelingsprocessen die hun temporele generatie vereisen, migratie naar hun eindbestemming in de corticale plaat, en de oprichting van korte- en lange afstand verbindingen1,2. Lange tijd was de klassieke manier om corticogenese te bestuderen gebaseerd op het gebruik van knock-out- of knock-in murinemodellen van genen van belang. Deze strategie, en met name het gebruik van voorwaardelijke knock-outmuizen, is echter tijdrovend en duur en levert soms extra problemen op met betrekking tot het bestaan van genetische redundantie of het ontbreken van specifieke CRE-drivers, onder andere kwesties. Een van de benaderingen die ontstond om te proberen deze problemen aan te pakken en die tegenwoordig op grote schaal wordt gebruikt om corticale ontwikkeling te bestuderen is in utero elektroporatie3,4. In utero elektroporatie is een techniek die wordt gebruikt voor somatische transgenese, waardoor in vivo targeting van neurale stamcellen en hun nakomelingen. Deze methode kan worden gebruikt om cellen te labelen door de expressie van fluorescerende eiwitten5,6, voor genmanipulatie in vivo (d.w.z. winst of verlies van functietesten)7,8,9, voor het isoleren van elektrogevormde cortices in vitro en culturing cellen8,10. Bovendien, in utero elektroporatie maakt tijdelijke en regionale controle van het beoogde gebied. Deze techniek heeft tal van toepassingen en is op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van neuronale migratie, stamceldeling, neuronale connectiviteit, en andere onderwerpen8,9,11,12.
Het huidige manuscript beschrijft het gebruik van een in utero elektroporatie variant, dubbel genoemd in utero elektroporatie, om de interacties van cellen in de hersenschors met verschillende temporele en ruimtelijke oorsprong te analyseren. Deze studies zijn uiterst complex om te voltooien bij het gebruik van murine modellen, omdat ze het gecombineerde gebruik van verschillende transgene lijnen vereisen. Enkele van de toepassingen van het protocol beschreven in dit document omvatten de studie van nauwe interacties tussen naburige cellen, evenals interacties tussen verre cellen door middel van lange afstand projecties. De methode vereist het uitvoeren van twee onafhankelijke in utero elektroporatie operaties, tijdelijk gescheiden en ruimtelijk, op dezelfde embryo’s om verschillende cel populaties van belang te richten. Het voordeel van deze aanpak is de mogelijkheid van het manipuleren van de genfunctie in een of beide soorten neuronen met behulp van wilde type dieren. Bovendien kunnen deze functionele experimenten worden gecombineerd met de expressie van cytoplasmatische of membraangelabelde fluorescerende eiwitten om de fijne morfologie van gerichte cellen, inclusief dendrieten en axonen, te visualiseren en mogelijke verschillen in cellulaire interacties te analyseren in vergelijking met een controle (d.w.z. cellen die alleen zijn gelabeld met het fluorescerende eiwit).
Het hier afgebakende protocol is gericht op de studie van cellulaire interacties binnen de neocortex, maar deze strategie kan ook worden gebruikt om interacties met extracortical gebieden te onderzoeken die kunnen worden gericht met behulp van utero-elektroporatie, zoals het subpallium of de thalamus13,14, of celcelinteracties in andere structuren, zoals het cerebellum15. Targeting van verschillende gebieden is gebaseerd op de oriëntatie van de elektroden en op de ventrikel waar het DNA wordt geïnjecteerd (laterale, derde of vierde). Met de hier beschreven strategie kunnen we een aanzienlijk aantal cellen labelen, wat handig is om algemene veranderingen in connectiviteit/innervatie in functionele experimenten te evalueren. Niettemin, om fijne veranderingen in connectiviteit te bestuderen, kan men gewijzigde versies van in utero elektroporatie gebruiken om sparser het etiketteren te krijgen en enige cellen16te identificeren. Samengevat, dubbel in utero elektroporatie is een veelzijdige methode die het mogelijk maakt gericht tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties en het bestuderen van hun interacties in detail, hetzij in controleomstandigheden of in combinatie met functionele experimenten, aanzienlijk verminderen van tijdelijke en economische kosten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De studie van celcelinteracties in vivo in regio’s met een hoge cellulaire dichtheid zoals de hersenschors is een complexe taak. Traditionele benaderingen, waaronder het gebruik van antilichamen om neurites te etiketteren, zijn niet geschikt vanwege het ontbreken van specifieke markers voor verschillende celpopulaties. Het gebruik van transgene murinemodellen, waarbij een bepaald celtype een fluorescerend eiwit uitdrukt, is nuttig om de neuronale processen te visualiseren, maar dit hangt af van de beschikbaarheid van der…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Cristina Andrés Carbonell en leden van de Animal Care-faciliteit van de Universidad de Valencia voor technische bijstand. We willen ook Isabel Fariñas en Sacramento R. Ferrón bedanken voor reagentia en het delen van hun apparatuur met ons. I.M.W wordt gefinancierd door een Garantía Juvenil contract uit de Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D wordt gefinancierd door de Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz heeft een Ramón y Cajal Grant (RYC-2015-19058) van het Spaanse Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Dit werk werd gefinancierd RYC-2015-19058 en SAF2017-82880-R (MICINN).
Materials
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System – 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System – Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
Referências
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologia do Desenvolvimento. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurociência. 103, 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
- Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
- Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
- Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
- Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
- Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Biologia do Desenvolvimento. 322, 345-354 (2008).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).
- Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
- Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
- Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
- Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
- Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
- Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
- Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
- Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
- Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).
- DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).
- Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).
